熒光分光光度計安裝與調試

一、安裝前的準備

在簽訂供貨合同后，距儀器的交貨日期一般都有2～3個月的時間，為了保證購買的儀器能正常使用，通常購買方需在這段時間著手安裝儀器前的準備事項了，以免因某些物品準備不及而推遲儀器的使用。

為充分發揮儀器的性能，使其長期處于穩定狀態下工作，熒光分光光度計的安置場所需滿足以下條件。

① 嚴格控制儀器室溫度與濕度。 分析測試的室溫應在5～30℃，儀器室的溫度控制在20～25℃，相對濕度應控制在45％～85％，以避免因室溫忽高忽低使熒光儀檢測系統性能不穩定。

② 儀器附近應避開強磁場、強電場。保證沒有強烈振動或持續的弱振動，附近沒有產生高頻波的儀器。

③ 環境中無腐蝕性氣體和紫外范圍內有吸收的有機和無機氣體。

④ 配備高精度穩壓電源，設立單獨的地線。供電電源電壓220V±10V，應避免與大負載設備的機器共用同一電源；設立單獨的地線，地線接地電阻：<1000Ω,，以免外界的電磁干擾。

⑤ 儀器臺應承重良好，臺面水平。

⑥ 遠離熱源，如可燃性氣體、電熱器、電爐等。

⑦ 避開陽光直射，應在干凈、灰塵少的儀器房。

要滿足以上條件，購買方通常需要準備以下物品：

① 一臺空調機，對于潮濕地區，還需配備一臺抽濕機；

② 一臺高精度交流穩壓電源(規格3kW，單相220V)；

③ 用戶必須做一條儀器專用地線 (和其它儀器的地線分開)，接地電阻小于1Ω；

④ 購買與用戶方所需測樣品相對應的化合物標準樣品，以備驗收儀器指標時使用；

⑤ 準備調試好儀器后，試機測試用的待測樣品液；

⑥ 控制儀器用的計算機，以及打印機 (有些儀器廠商提供，則不需準備)。

如果，所購儀器為瞬態／穩態熒光儀，可能還需準備高純氬氣 (純度大于99．999％)、高純氮氣 (純度大于99．999％)、液氮等氣體。

二、儀器安裝與調試

儀器到貨后，首先檢查包裝箱上的標識是否齊全，有些進口儀器用木箱裝運，在木箱外包裝上會有防振檢驗標記，如果在運輸過程中發生一定程度的振動，標記會發生顏色變化，需認真查看。儀器安裝與調試的大致流程如下。

(1) 開箱檢查 一般儀器廠商都會派專業技術人員負責儀器的開箱、安裝、驗收與培訓。用戶方不可私自開箱，應在雙方都在場的情況下，由廠商的技術工程師開箱，雙方對照裝箱單與供貨合同仔細核對每一個儀器部件，確認配套的附件都有。核對產品合格證，操作使用手冊，維修手冊等是否齊備。

(2) 安裝 等核對完每一個儀器部件都完好無損后，就由技術工程師準備安了。安裝的順序是先安裝硬件，后裝軟件。①將串行線連接到計算機上與熒光儀主機相對應的端口。安裝時使用的電源插座必須是具有良好接地端的三芯插座，按照儀器使用說明書的指導方法，連接主機接口與工作站接口、電纜和插頭。②安裝氙燈。在安裝燈時，務必關掉主機、燈電源，將電源的電源線拔離，確認儀器完全斷電，以防觸電事故的發生。③在與儀器連接的計算機上安裝儀器操作軟件。

(3) 驗收 儀器安裝完畢，需對儀器進行調試驗收。按照儀器操作使用手冊的要求打開儀器，檢查是否能正常顯示和運行，檢查儀器上的功能是否都能正常運行。在驗收過程中，要針對每一個部件進行樣品測試，檢查部件能否正常工作。有條件的話，通常要對照儀器出廠時的性能指標用標準溶液作指標測試，測到的各項指標均需達到出廠時的標準。如果與合同規定的部件有出入或有器件損壞，可立即要求供貨商賠償或更換。驗收完后要簽訂一個技術驗收報告。用戶可以提供自己的樣品用新機測試，對測試過程中出現的問題可以隨時請教現場的技術工程師，這樣一方面有利于自己更快地熟悉儀器使用，另一方面，也使儀器的驗收更有說服力。

(4) 培訓 技術工程師對儀器使用者進行應用操作培訓，主要講解熒光儀的硬件組成、調試步驟、開關機順序以及重要部件的維護保養等內容。一般儀器的安裝調試過程也是一個培訓過程，儀器使用人員應認真咨詢儀器的使用、維護和售后服務及儀器相關損耗品的購買渠道等相關情況。儀器使用者在培訓中應親自用樣品對儀器進行完整操作。有些儀器公司還會另外舉行專門的技術培訓講座，對這個儀器的使用人員進行一次培訓。

三、主要性能指標及測試方法

熒光分光光度計的性能指標通常包括：信噪比、波長準確度、波長重復性、檢出限、線性、光譜校正誤差、熒光池成套性、光譜儀探測范圍、熒光壽命測量范圍、光源、單色器、是否提供變溫環境等。通過這些指標參數，可以對儀器的基本性能有大致了解。這些技術指標的測試方法可參照JJG (教委) 025—1996及JJG 537—2006《熒光分光光度計檢定規程》，也可以參照儀器供應商提供的驗收方法進行。校準的周期視情況而定，但是當條件改變(例如更換光源燈、光電倍增管等)或對測量結果有懷疑時，都應及時對儀器進行校準。對幾個主要的技術指標測試方法介紹如下。

四、信噪比 (靈敏度) 測試

通常以純水的拉曼峰的信噪比來測試熒光儀器的檢測靈敏度。從譜圖可以得到純水的拉曼峰的峰高值S，以及噪聲的平均值N，靈敏度=S／N，可以得到該儀器的靈敏度指標。具體操作步驟如下：

① 先打開氙燈，然后開儀器主機，預熱30min。

② 將純水以石英熒光池盛裝后，放人儀器的液體樣品架內。

③ 設置分析測試的參數，激發波長λem=350nm，發射掃描的范圍300～430nm,激發發縫△λem=5nm，發射狹縫△λem =5nm，延時Dwell time=0．2s，水的拉曼峰λem =397nm。

④ 開始靈敏度測試實驗：先以純水調節靈敏度使發射波長λem =397nm，儀器示值在40％左右。再將發射波長退回到300nm，調儀器零位。掃描發射單色器，記錄300～400nm發射光譜曲線。發射波長397nm附近的峰值即為S。然后在峰值處采用時間掃描記錄2min，記錄噪聲曲線波動最大的峰值即為N。

⑤ 得到靈敏度測試指標(以5／N表示)。

五、波長準確度與重復性測試

分別測試激發單色器和發射單色器的波長準確度與重復性。

(1) 激發單色器的波長準確度與重復性測試 將發射單色器置零級位置，并將漫反射板 (或者無熒光的白色濾紙條) 放入樣品室，儀器響應時問設置為“快”，掃描速度設置為“中”，使用實際可行的最窄狹縫寬度，對激發單色器350～550nm的波長范圍進描，在所得譜圖上尋找450．1nm附近的光譜峰，并確定其峰值位置。連續測量3次，按式1計算波長正確度：
3
△λ= ? ∑λi—λr (4-1) 
i=1

式中λi——波長測量值；

λr ——汞燈參考波長值。

按公式2計算波長重復性：
3
δλ=max|λi— ? ∑λi| (4—2)
i=1

按公式3計算波長準確度：

Uλ=△λ±δλ (4—3)

(2) 發射單色器的波長準確度與重復性測試 將激發單色器置零級位置，并將漫反射板(或者無熒光的白色濾紙條)放入樣品室，儀器響應時間設置為“快”，掃描速度設置為“中”，使用實際可行的最窄狹縫寬度，對發射單色器350～550nm的波長范圍進行掃描，在所得譜圖上尋找450．1nm附近的光譜峰，并確定其峰值位置。連續測量3次，并分別按公式1～式3計算波長正確度、波長重復性與波長準確度。

六、線性測試

測量熒光分光光度計的線性，作為一個分析儀器測量范圍方面的衡量指標，是十分必要的。其測試方法如下。

用0．05mol／L硫酸溶液作空白溶液，適當選擇靈敏度擋和狹縫，依次測量表4-2的各濃度硫酸奎寧標準溶液。根據激發波長λem =350nm、發射波長在λem =450nm左右的原則，設定兩側的波長或選擇濾光片。分別對表4-2中4種濃度的工作標準溶液與空白溶液進行連續交替3次的測量，計算每次測量的熒光強度平均值。用最小二乘法對4種標準溶液的濃度和熒光強度測量平均值進行處理，得到的線性相關系數，即為測量線性的結果。

七、分辨率測試

(1) 激發單色器的分辨率 掃描激發單色器應能分辨出汞三線365．02nm，365．48nm和366．33nm所對應的測量峰值。

(2) 發射單色器的分辨率 測掃描發射單色器應能分辨出汞三線365．02nm，365．48nm和366．33nm所對應的測量峰值。

八、光譜峰值強度的重復性測試

置激發波長λem =350nm，激發狹縫λem =10nm，發射狹縫λem =10nm，用1．00×10^-7 g／mL的硫酸奎寧溶液，調節靈敏度，使發射波長λem =450nm時，示值在80％左右，繼續照射3min后，對發射波長365～500nm范圍重復掃描3次。

由公式4計算重復性：
3
δF=max|Fi— ? ∑Fi| (4—4)
i=1

式中Fi——每次測量的熒光峰值。

九、熒光池的成套性測試

用校準過的熒光分光光度計進行熒光池成套性的測試。具體操作如下。

置激發波長λem =350nm，發射波長λem =450nm，熒光池中裝入1．00×10^-6 g/mL的硫酸奎寧溶液，放入光路時帶有標志的一面正對進光方向。將儀器示值調至95％，測量其它各熒光池的示值，凡示值差不大于1．0％的熒光池可以配成一套。

十、光譜儀的探測范圍

該指標主要表征檢測器性能，一般光電倍增管檢測器探測范圍在190～870nm，選用InGaAs或Ge探測器后，探測范圍可擴展到800～l700nm。

十一、熒光壽命測量范圍

熒光壽命測量范圍是熒光儀瞬態系統的一個重要參數，根據儀器所用光源及檢測器的不同，通常分為微秒級、納秒級、皮秒級。

十二、氫納秒燈的穩定性

如果熒光儀配有可測量熒光壽命的氫納秒燈，它可測壽命的范圍是25μs～10ns。納秒燈的性能測試如下：洗氣后充入一定量的高純氫氣，設置燈頻率為40kHz，電壓7．0kV，激發波長λem =357nm，發射波長λem =357nm，測量范圍0～100ns，平均數據采樣率小于2000點／s，以分散膠體為樣品進行壽命測試，16h后再次測試，比對兩次測試結果。

十三、熒光光譜的校正

熒光分析儀使用的好壞除了與熒光分析儀自身的性能密切相關外，儀器的調試工作也起到了決定性作用。因儀器調試工作不到位，測定數據偏差大而無法使用的例子在現實中也時有發生。

由于激發光源在不同波長處發射的光子數存在差異，單色器對各種波長光線的透射率也不盡相同，且與偏振光有關的檢測器 (如PMT) 對各種波長的檢測效率也不一樣。而熒光光譜是測定各個不同波長下的熒光體的熒光強度，這些光學部件的光譜特性的差異無法通過扣除空白溶液的方法消除，所以需要對熒光光譜進行校正。

(1) 激發光譜的校正 以羅丹明B光量子計數器來校正。首先校正零點；然后把羅丹明B-乙醇溶液 (3g／L) 盛入石英三角池，用量為充滿石英三角池的2／3容積。將其置入樣品室，加入高通濾光片濾去雜散光，僅計6 30nm熒光通過。固定發射波長在630nm，掃描激發單色器 (激發掃描的范圍從198．6～601．4nm)，將檢測到的信號保存到計算機軟件上并進行歸一化，得到激發光強度與波長的關系，應為一條與波長無關的直線。移去石英三角池與濾光片，放入分析試樣進行激發光譜掃描，即可得到樣品已校正的激發光譜。激發波長200～600nm范圍內，都可以用此法校正。

(2) 發射光譜的校正 在校正完激發光譜后 (激發光強度已與波長無關)，把擴散體放入樣品室，發射波長設定為198．6nm，然后進行激發單色器、發射單色器同波長的同步掃描(掃描的范圍從198．6～601．4nm)，將測得的信號保存到計算機軟件上并歸一化，歸一化后的輸出信號應為一條與波長無關的直線。移去擴散體，放入試樣進行發射光譜掃描，即可得到樣品已校正的發射光譜。發射波長200～600nm范圍內，都可以用此法校正。

(3 ) 長波長發射光譜的校正 需校正的發射波長處于長波長區600nm甚至更長，副標準光源作為燈源，用它來校正發射光譜的范圍在發射波長處于500～900nm范圍內。將副標準光源和擴散體放在樣品倉內，預熱5min，然后進行發射掃描(掃描的范圍從498．6～901．4nm)，移去副標準光源與擴散體，放入試樣進行發射光譜掃描，即可得到樣品已校正的發射光譜。

(4) 長波長激發光譜的校正 在校正完長波長發射光譜后，校正零點，將擴散體放在樣品倉內，然后進行激發掃描(掃描的范圍從498．6～901．4nm)，移去擴散體，放入試樣進行激發光譜掃描，即可得到樣品已校正的激發光譜。激發波長500～900nm范圍內，都可以用此法校正。

現在某些型號的商品熒光儀在出廠時已經將激發光譜與發射光譜的校正圖儲存在軟件 中，用戶在測試時可以根據測試需要直接調出來進行譜圖校正，更加簡便快速。