胸腺肽的制備及檢測實驗

實驗概要

本實驗從動物的胸腺中提取了胸腺肽，并進行了pH值、熱原、超敏反應、急性毒性試驗、無菌檢查、多肽含量測定等相關檢測。

實驗原理

胸腺肽是存在于人及多種動物胸腺內的一組具有免疫調節活性的熱穩定性多肽。分子量多在8 000～13 000之間，等電點在35～95之間。胸腺肽的主要功能為誘導T細胞分化增殖，放大并增強成熟T細胞對抗原或其它刺激物的反應及維持機體免疫平衡狀態。由于它的分子量多是小于10 000的多肽，故基本無免疫原性，所以由一種動物胸腺中提取的小分子多肽，可用于其它各種動物及人類，而不會引起超敏反應。在實際工作中，主要從牛、豬、羊等動物的胸腺中提取胸腺肽。

主要設備

高速組織搗碎機、低溫冰柜、電熱攪拌器、離心機、不銹鋼濾膜濾器、超濾器、紫外分光光度計及檢測E玫瑰花環試驗所用儀器等。

實驗步驟

1. 制備勻漿：將凍存的動物胸腺取出融化，摘除脂肪及結締組織，洗凈，用絞肉機絞碎，將絞碎的胸腺內加入適量注射用水(約為胸腺的25倍)，用高速組織搗碎機高速勻漿2次，每次1min，將勻漿置-20℃凍結。

2. 去除雜蛋白：凍結勻漿緩緩融化后，置電熱攪拌器上加熱至約80℃，并不斷攪拌，共加熱攪拌15min。以3 000r/min離心20min，棄沉淀，取上清。

3. 澄清及超濾：將上述上清液用1μm濾膜加壓過濾，過濾后的液體其濁度不大于5度。將該澄清液體通過超濾器，用分子量10 000膜超濾，透過液即為胸腺肽溶液。

4. 后處理：用Folin酚法測多肽含量，根據含量，分裝安培瓶并凍干，封口后待檢定。

5. 檢定

   1) pH值

取本品用酸度計準確測定酸堿度，其pH值應為6.0～7.5。

   2) 熱原

取3只符合要求的家兔，按規定進行觀察后，每只通過耳靜脈注入75mg/kg胸腺肽藥液，觀察體溫升高情況，如不符合規定，應取5只家兔復檢。判定標準為：在初試3只家兔中，體溫升高均在0.6℃以下，且3只家兔體溫升高總數在1.4℃以下時；或在復試的5只家兔中，體溫升高0.6℃或0.6℃以上的家兔不超過1只，并且初試和復試合并8只家兔的體溫升高總數不超過3.5℃時，均認為供試品熱原檢查合格。

   3) 超敏反應

取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品0.5ml，連續3次，于20天后即第4次自耳靜脈注入本品2.0ml，應無超敏反應現象發生。

   4) 急性毒性試驗

取小鼠，自尾靜脈注入本品0.45ml，同時腹腔注射2～3ml，48h內不應有死亡。

   5) 無菌檢查

將本品分別接種到用以檢測需氧菌、厭氧菌及霉菌用培養基上，37℃培養1周，應無菌生長。

   6) 多肽含量測定

用Folin酚法測定多肽含量，應符合規定。

   7) 活力測定

采用E玫瑰花環試驗，對照管中加入淋巴細胞及綿羊紅細胞，試驗管中加入淋巴細胞、綿羊紅細胞及適量本品。試驗管的E玫瑰花環率應較對照管高10%以上為合格。

注意事項

1. 胸腺勻漿時應細，眼觀應呈細膩狀，否則可延長勻漿時間，增加勻漿次數。胸腺應采自幼齡動物，且新鮮無異味。

2. 各步驟所用餾水應均為無熱原注射用水。

3. 過濾時，壓力不可過高，否則濾膜破裂，藥液則須重濾。