腫瘤無創診斷技術在癌癥檢測中應用

腫瘤無創診斷技術即液體活檢（liquid biopsies）的出現，標志著人類在攻克腫瘤的道路上又前進了一大步。2015年液體活檢技術被MIT科技綜述雜志（MIT Technology Review）評為年度十大突破技術之一；2017年6月，世界經濟論壇與《科學美國人》雜志的專家委員會聯合選出的2017年度全球十大新興技術榜單，其中腫瘤的無創診斷技術成功入選并榮膺榜首。

一、液體活檢產業鏈分布

從產業鏈來看，液體活檢可分為6個子領域，即上游的捕獲、基因擴增、試劑以及儀器市場；中游檢測服務市場以及下游數據市場。

1. 上游產品技術壁壘高，涉足企業少

目前液體活檢尤其是CTC檢測技術受上游捕獲方式的局限較大，是限制液體活檢應用的最大難點，器械主要包括CTC分析儀、數字PCR儀、二代測序儀等，試劑盒的關鍵原材料是抗體和芯片。這些技術、儀器和原材料的生產技術壁壘很高，ZL保護嚴格，國外公司（賽默飛世爾、奧林巴斯等）形成了高度市場壟斷。國內已有幾家公司通過并購實現二代測序儀的生產，但產品性能與國外產品相比差距較大，產品同質化嚴重，競爭激烈。

2. 中游檢測服務市場企業布局較多

液體活檢技術可應用于腫瘤的早期篩查、檢測、用藥指導、評估、觀察，貫穿癌癥診治全程，目前液體活檢的研究和應用涵蓋腫瘤篩查、腫瘤分期分級、預后評估、精準用藥（個體化治療）、耐藥監控、腫瘤轉移與復發多個領域。更多的企業布局在中游檢測服務市場，通過渠道快速占有市場或積累樣本厚積薄發。

3. 下游環節主要依賴銷售能力與測序環節后對數據進行分析處理以及解讀

數據解讀需要對癌癥基因組學數據的深度認知作為支持，因此不僅需要聯合測序技術與組學研究，還依賴于測序樣本的積累，但由于液體活檢并不是主要的腫瘤檢驗方式且價格偏高，尚不能進入醫保目錄，受眾規模小，醫院采購量有限，中游企業對銷售渠道的依賴比較嚴重，目前涉足企業有藥明康德、華大基因、首度基因、貝瑞和康等少數企業。

4. 全國集聚情況

對火石數據庫中101家液體活檢企業全國分布情況進行統計，上海、北京、廣州三省市排名前三，分別為20家，19家和17家；其次為江蘇和浙江，分別為13家和11家。

二、液體活檢技術簡介

目前，臨床研究中，液體活檢技術主要包括游離循環腫瘤細胞（CTCs）檢測、循環腫瘤DNA（ctDNA）檢測、外泌體及循環RNA（Circulating RNA）檢測等，與傳統的組織活檢相比，液體活檢具備實時動態檢測、克服腫瘤異質性、提供全面檢測信息等獨特優勢。

1. CTC檢測：技術發展快，臨床研究熱度高

CTC技術主要通過檢測血液中的循環腫瘤細胞（CTC，Circulating Tumor Cells）的數量來進行診斷。通過對血液中CTC的數量以及蛋白表達、序列檢測等可以獲取腫瘤的病變信息。目前，CTC主流技術主要分為以下幾種：Oncoquick（基于細胞密度對CTCs進行分離）、ISET（依據細胞大小使用孔徑約8微米濾膜分離CTCs）、MACS（通過免疫磁珠標記進行上皮性CTCs的分離）、Cell Search（使用EpCAM抗體包被的鐵磁珠進行免疫分離）、IFISH-CTC（免疫熒光染色結合FISH技術進行非血緣性細胞染色體異常檢測）、RT-PCR（基于腫瘤特異性基因的表達分析）、AdnaTest（通過特定抗原表達和腫瘤相關標志物分離，提取RNA進行RT-PCR分析）、CTC-chip（使用含包被EpCAM抗體微柱陣列的芯片）。

截至2018年4月，全球共有CTC檢測相關研究589項，其中美國259項，中國96項。

在成果轉化方面，僅有Immunicon公司的Cellsearch CTC 檢測系統2004年通過FDA認證，也是唯一通過FDA批準用于臨床的一代CTC檢測系統，可以說是行業內的金標準。2012年Cellserach系統通過CFDA認證進入中國市場。Immunicon公司已被強生子公司Veridex所收購。盡管一代CTC技術領先進入臨床應用，但目前技術水平尚不完善，只能用于對CTC數量的檢測，無法進行進一步的深入檢測，加上靈敏度較低，應用局限于轉移性乳腺癌、轉移性結直腸癌和轉移性前列腺癌。

2. ctDNA檢測：市場處于萌芽期，亟待攻克技術局限性

ctDNA技術通過對血液中ctDNA是否攜帶有腫瘤特異性的突發，或其他基因組改變信息進行檢測。研究結果表明，該技術能夠真實反映實體瘤組織中的基因突發圖譜頻率，是治療效果評價與治療后臨床隨訪的重要監測指標。ctDNA檢測技術目前主要為數字 PCR、BEAMing 技術、標記擴增深度測序（TAM-Seq）、癌癥個體化深度測序（Capp-Seq）。

ctDNA的檢測平臺目前有二代基因測序和數字化PCR，可分別對ctDNA的序列信息和序列數量做檢測，適用于非小細胞肺癌、乳腺癌、結直腸癌、皮膚癌等常見腫瘤，檢測的目標基因目前多以KRAS、PTEN、EGFR、BRAF等熱門基因為主。ctDNA的片段捕獲需要提前知道和準備待檢測突變，突變文庫的制備過程繁瑣且高成本。與CTC相比，二者均屬于液體活檢范疇，高靈敏度和低成本，適用于大多數腫瘤檢測，并且可同時從血液中提取，獲得互補信息。

截至2018年4月13日，全球共有ctDNA檢測相關研究212項，其中美國56項，中國30項。

2016年4月，美國FDA批準了Epigenomics公司以血液為基礎篩查結直腸癌的EpiproColon技術。EpiproColon（Septin9基因甲基化檢測試劑盒）能檢測血液中Septin9基因V2區域發生甲基化的CpG島bisDNA序列。臨床數據顯示EpiproColon可檢出68%的病例。這是FDA批準的第一款基于ctDNA進行腫瘤篩查的產品。

3. 外泌體(exosome)檢測，液體活檢新技術

外泌體與腫瘤發展：外泌體是腫瘤診斷、腫瘤發展和腫瘤治療的重要參與者。外泌體的主要功能就是遞送各種生物分子，包括蛋白質、多肽配體、DNA和RNAs。因此腫瘤細胞分泌的外泌體在腫瘤發展和治療中扮演角色主要表現在以下方面：1、促進腫瘤細胞發展，侵襲和轉移；2、促進腫瘤的血管新生；3、腫瘤免疫調節；4、腫瘤化療的增敏作用。

通過超速離心法或者磁珠法提取外泌體后，分離純化出來的exosome可以做蛋白研究，也可以做RNA（microRNA和LncRNA）研究，36%的研究人員通過Western blot或其他方法來鑒定蛋白，29%的人員利用qPCR對microRNA表達譜進行分析，9%利用芯片進行microRNA表達譜分析。同時，新一代測序的用戶也不少，13%的人員利用NGS開展microRNA/小RNA研究，9% 開展mRNA研究，另外基于組學研究的質譜分析法也越來越常用。外泌體分析數據庫 ExoCarta，目前已包含9769種蛋白質，4946種mRNA條目，3408種mRNA，2838種miRNA，1116種脂質條目。

外泌體（exosome）近年來成了研究領域里的明星，大量的相關研究見諸報道。尤其2015年以來外泌體研究與應用飛速發展，國自然基金外泌體中標項目和文章發表數量大幅增加。

目前外泌體的大部分工作還是停留在科研階段，后續的生物標志物開發和驗證不多，而診斷和療法的開發就更少。研究者認為，exosome的定性和定量研究是個快速發展的市場。同時，循環生物標志物的市場也存在著機遇和挑戰。

三、液體活檢行業面臨的問題

1. 液體活檢僅被作為替補方案，難以搶占傳統活檢市場份額

患者如何在液體活檢和組織活檢之間選擇，取決于檢查的目的是什么。許多腫瘤的CTC、ctDNA數量不足或者腫瘤存在明顯異質性，導致腫瘤即使突變，液體活檢試劑盒也不一定能捕捉到CTC或ctDNA，血液檢查結果可能出現假陰性。因此只要患者能夠提供足夠的組織樣本，初始診斷優先選擇組織活檢；如果組織樣本不足量，液體活檢可以是替補方案。因此，液體活檢不會替代其他檢查方式，也難以搶占傳統活檢的市場份額。

2. 液體活檢尚未進醫保，價格高，推廣難度大

低通量液體活檢產品價格低廉，但是檢出率也較低，應用前景有限。高通量產品對部分腫瘤的檢出率高達80%-90%，但價格偏高。同時，這類產品尚未納入醫保目錄，普通民眾較難獨立接受如此高昂的價格。

3. 對ctDNA產品的可靠性質疑

年初，美國臨床腫瘤學會（ASCO）在《Journal of Clinical Oncology》雜志發表的綜述文章，對ctDNA的分析有效性、臨床有效性和臨床實用性提出質疑。調查結果顯示：（1）以前的部分研究指出，ctDNA更適合用于晚期癌癥的篩查，而非用于臨床早篩，但是目前看來，即使用于晚期癌癥，其有效性和合理性也沒有足夠的證據來證明；（2）還沒有足夠的證據支持常規使用ctDNA檢測早期癌癥，并以此做出治療決策、監測治療效果、尋找殘留癌細胞；（3）液體活檢與組織檢測經常結果不一致，因此陰性液體活檢結果應與腫瘤組織基因分型對比確認。文章強調，ctDNA檢測結果必須與其他信息結合，才能為患者提供最佳選擇。

四、結語

液體活檢是一項具有挑戰性的新技術，隨著研究的不斷深入，越來越多的研究成果將有望實現成果轉化，液體活檢將成為腫瘤診斷的重要技術手段。液體活檢要廣泛進入臨床應用也面臨眾多挑戰，不僅需要檢測技術靈敏度和特異性的提升、臨床研究的廣泛積累，還需要建立相應的檢測標準、建設規范的監管體系。