腫瘤壞死因子α生物學活性檢測

L929rTNF-α

放線菌素DNA酶胰蛋白酶RPMI16403H-TdRPPOPOPOP二甲苯

濾紙培養板吸管滴管試管加樣器CO2培養箱顯微鏡超凈臺

1.  0.25 ％胰蛋白酶消化處于對數生長期的L929細胞

2.  用RPMI1640洗滌細胞后，調整細胞濃度至2×10⁶ /ml

3.  加入³H-TdR，20 μci/ml

4.  置37 ℃，5 ％CO₂培養箱中2～3 h，搖動1 次/30 min

5.  用RPMI1640洗滌2次，800 rpm×5 min/次

6.  調整細胞濃度至2～3×10⁵ /ml后，加入96孔培養板中，100 μl/孔

7.  加入不同稀釋度的待測樣本（設三個重復孔）

　　　　　　　　　
8.  加入放線菌素D，使放線菌素D最終濃度至1 μg/ml，用時設放線菌素、完全培基陰性對照和rTNF-α標準品陽性對照，37 ℃，5 ％CO₂培養中24 h

　
9.  加入3 ％胰蛋白酶和0.25 ％DNA酶各10 μl/孔，37 ℃，30 min

　　　　　　　　　　　　
10.  用DYQ-Ⅱ型多頭細胞收集器收集樣品于"9999"型玻璃纖維濾紙上

11.  烤干后，進行β計數

　
12.  結果判定

　　
（1）TNF-α作用24 h后，在倒置顯微鏡下判定50 ％L929細胞殺傷的稀釋度即為1個TNF-α活性單位。

　　
（2）根據測得的cpm值按下列公式計數活性單位

　　　　　　　　      放線菌素D對照組cpm-實驗組cpm
TNF-α活性單位（U/ml）＝──────────×標準品活性單位×待測樣品稀釋倍數

                                  放線菌素D對照組cpm-標準品cpm

1.  用于標記³H-TdR的L929細胞要處于對數生長期，否則³H-TdR摻入率低，影響實驗結果。

　　
2.  標記后的L929細胞應充分洗滌，以洗掉游離的³H-TdR，則會影響完全培基對照組cpm值。

　　
3.  胰蛋白酶和DNA酶濃度和消化時間要嚴格控制，酶均要摸索最適濃度和時間。否則，消化時間過長或過短者會影響實驗結果。

　　
4.  為了增強檢測系統的敏感性，在測定系統中加入放線菌素D，但濃度不宜過大，一般最終濃度為0.5～1 μg/ml。

　　
5.  在測定PHA等絲裂原誘導的PBMC培養上清時，要注意排除TNF-β（淋巴毒素）的影響。因為TNF-β細胞毒生物學作用等很多生物學效應均與TNF-α相似。