實驗材料 測序級豬胰蛋白酶
試劑、試劑盒 碳酸氫銨碳酸氫銨緩沖液乙腈 碳酸氫銨緩沖液消化緩沖液
儀器、耗材 真空離心機烤箱
實驗步驟
許多凝膠染色方法適用于后續的 MALDI-TOF 肽質量指紋圖譜（PMF ) 分析。在第 14 章已經比較討論了一些染色方法的性能和兼容性。
3.1 膠內消化
凝膠消化方法改編自 Jensen 等。
對于凝膠處理和消化步驟，必須認真處理樣品，盡量減少外源性角蛋白的污染（如頭發、皮膚、羊毛衣服、氣流、通風冷卻等）（見注釋 1)。
1. 從二維聚丙烯酰胺凝膠挖蛋白質點
( 1 ) 將 1 ml 槍頭在離尖端 5 mm 處用刀片切除，做一個打孔器（切口直徑 1~2 mm ) ( 見注釋 2) 。
( 2 ) 挖取凝膠點，并轉移到離心管中。
2. 清洗凝膠碎片
( 1 ) 用 100 μl 碳酸氫銨緩沖液清洗（振蕩 15 min) ，然后棄上清液。
( 2 ) 用 100 μl 乙腈/碳酸氫銨緩沖液洗兩次（振蕩 15 min) ，然后棄上清液。
( 3 ) 用 100 μl HPLC 級乙腈清洗（振蕩 15 min) 使凝膠碎片收縮，然后棄上清液。
( 4 ) 離心式蒸發器上真空干燥凝膠碎片。
經上述洗滌后，凝膠片段在 -20°C 可以貯存幾個星期，可再用于凝膠消化。
對于二維凝膠，在凝膠消化之前沒有必要進行半胱氨酸殘基的還原和烷基化（見注釋 3)。
3. 膠內消化（見注釋 4 和注釋 5)
( 1 ) 將凝膠碎片置于冰上（見注釋 6)，加入 8 μl 冷卻的消化緩沖液。
( 2 ) 20 min 后，用少量碳酸氫銨緩沖液調整以覆蓋凝膠。
( 3 ) 37°C 溫育 4 h ( 或過夜，見注釋 7) 。
4. 多肽片段的提取、濃縮、脫鹽
1 ) 多肽片段的提取
( 1 ) 加入 20 μl TFA 溶液（超聲 15 min) ，提取胰蛋白酶消化產生的多肽片段。上清液保存在 500 μl 離心管中。
( 2 ) 用 20 μl 的 3 : 2 乙腈/TFA 液提取（超聲 15 min) 。收集上清液。
2 ) 肽濃縮和脫鹽
( 1 ) 通過真空離心機將上清液濃縮到大約 10 μl 的體積。這一步去除乙腈（否則多肽片段將不能固定在疏水色譜介質），并減少體積量至合適的范圍以便能進行下一步的色譜操作。
( 2 ) 牢牢固定 ZipTip 在 10 μl 的可調移液管上（背壓可能很高）。
( 3 ) 用 10 μl 的 3 : 2 乙腈/TFA 溶液清洗 ZipTip 5 次。去除清洗液。
( 4 ) 用 10 μl 的 TFA 溶液平衡 ZipTip 5 次 。去除清洗液。
( 5 ) 不用抬高吸管尖頭，慢慢吸出和分散 10 μl 濃縮上清液 10 次，固定住肽片段。
( 6 ) 用 10 μl TFA 溶液清洗固定的肽（脫鹽）4 次。去除清洗液。
( 7 ) 用 2 μl 的 1:1 乙腈/TFA 溶液洗脫多肽片段至 500 μl 微量離心管中。
3.2 MALDI-TOF 肽質量指紋圖譜
( 1 ) 在 MALDI 過程中，樣品通常是與芳香有機物共結晶出來。這些有機物通常是酸性化合物（基質），主要性質是吸收紫外激發波長（一般為氮激光的 337 nm 波長或三倍頻率的 Nd: YAG 激光的 355 nm 波長）。在解吸過程中，當紫外激光發射時，基質的芳香基團（大量存在，超過 10000 : 1 ) 吸收紫外能量，導致基質升華為氣態，不致于使樣品分解或解離。
( 2 ) 電離過程是發生在帶電的基質離子和中性的肽片段之間（離子-分子反應）的高濃度、不停擴張和冷卻的氣相質子交換過程。
( 3 ) —旦解吸和電離，TOF 管中的樣品加速沖向探測器，它的速度（在固定長度飛行管的 TOF) 與 m/z 的均方根成正比。
( 4 ) 該反射鏡（靜電鏡）修正初始動能分布，因而能提高質量分辨率和質量準確度 ( 具有較大動能的等壓離子在反射鏡中有更大的路徑，在探測器聚焦平面以較低的動能 )。
( 5 ) 延遲或脈沖離子的萃取會糾正初始空間分布，因而再次提高分辨率和質量準確度（根據離子從源頭到分析儀提取開始時的位置，解吸室的等壓離子將會加速空間分布)。
現在有許多涉及 MALDI-TOF 和 MS 基本知識的專業文獻或書，也可參閱它們。
MALDI-TOF 質譜技術是 PMF 的首選，主要是因為 MALDI-TOF 具有一些優勢特點。
( 1 ) 軟電離技術（在 MALDI 過程中肽片段能保持完整)。
( 2 ) 電離方法也適合不同多肽混合物的分析，該方法較耐污染（緩沖液、鹽、增塑劑等) 。
( 3 ) 方法靈敏度高（有 MALDI 過程和 TOF 質量分析儀) 。
( 4 ) 良好的分辨率，目前已經超過 15000 [ 全寬，半質量（FWHM )] ，在感興趣的質量范圍可檢測單一同位素峰。
( 5 ) TOF 分析儀具有很高的質量精度（通常為 10~30 ppm) 。
( 6 ) 能快速得到實驗數據。