考馬斯亮藍法測蛋白質含量是0~1 000μg/mL。
考馬斯亮藍一定范圍內與蛋白質濃度成正比,因此可用于蛋白質的定量測定。
測定含量:
該方法用于大多數蛋白質的定量是比較精確的,但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0.2%影響測定結果,如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于細胞骨架的檢驗。
濃染液:將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50mL 95%乙醇,加入100mL 85%的磷酸,然后,用蒸餾水補充至1000mL,此染液放4℃至少6個月保持穩定。
樣本準備:盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品,例如測定抗體,可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的,也可用抗體作為標準蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之間繪制標準曲線。
溶解:將待測樣本溶于100~1緩沖溶液中,該緩沖溶液應與制作標準曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。
稀釋:按1:5用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液,如出現沉淀,過濾除去。
作用:每個樣本加5mL稀釋的染料結合溶液,作用5~30min。染液與蛋白質結合后,將由紅色變為藍色,在595nm波長下測定其吸光度。注意,顯色反應不得超過30min。
計算:根據標準曲線計算待測樣本的濃度。