酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸側鏈的硝化與亞硝化作用構成了蛋白質硝化PT M 的主要部分。這些加成反應由發育、氧化應激及衰老過程中產生的活性氮介導。活性氮的增加是由一氧化氮和活性氧的過度反應或調控紊亂造成的（Yeo et al.，2008)。活性氮和活性氧能夠靶向于DNA、脂類和蛋白質 (Barnes e ta l.，2003)。根據產生的自由基，活性氮將會優先與酪氨酸殘基反應，形成3-硝基酪氨酸或3-亞硝基酪氨酸(Beckman et al.， 19如\ 酪氨酸的硝化修飾的特性也許可通過產生的加合物得到最好的描
述。研究表明，酪氨酸硝化水平的增加與衰老相關的神經退行性疾病有關 ，而且可以作為氧化應激的一個生物標志物(Yeo et al.， 2008)。 在正常生理條件下，硝化酪氨酸加合物的形成會被存在的還原劑, 如谷胱甘肽阻止(C henet al., 2004)。 酪氨酸硝化會將結合的羥基的 PKa 從 10.1改 變 至 7. 2, 并導致被修飾蛋白質結構和功能上的改變(Sokolovsky et al., 1967)
目前沒有能夠直接分離硝化多肽和蛋白質的選擇性富集策略。這 可 能是由于這種PT M 的一氧化氮基團的化學活性較低。在有連二亞硫酸鈉（dithionite，DTH)存在的還原環境中，這些相對惰性的部分可被轉換成胺類, 從而易于與標簽基團反應（Yeo et al.，2008)。隨 后 ，標簽化的多肽可通過蛋白質組學方法選擇性分離和分析。 目前應用最普遍的鑒定蛋白質硝化修飾的方法，是將2I > G E 與某一給定的硝化加合物的特異性抗體的免疫印跡分析結合 (Zhan and Desiderio, 2004)。 蛋白質通過2D —— G E 實驗被 解 析 ，并通過適當抗體直觀的觀察到發生此種修飾的蛋白質。進而將免疫印跡陽性的斑點從膠上切 離 ，消化后利用質譜進行鑒定 (Zhan and Desiderio, 2004) 。 對于酪氨酸硝化修飾，在搜索質譜數據鑒定加合位點時，可根據加合物的不同進行鑒別: 硝化作用產生一個 45 D a 的標稱質量漂移，而亞硝化作用產生一個 29 D a 的標稱質量漂移。
賴 氨 酸 和 精 氨 酸 的 甲 基 化 修 飾（+ 14 D a ) 以 及 賴 氨 酸 乙 酰 化 修 飾（+ 4 2 D a ) 這 兩 種P T M 類 型 在 組 蛋 白（histone) 密 碼 中 的 作 用 正 在 被詳 加 分 析 (Jenuwein and Allis, 2001;Strahl and A U i s ，2000)。第 一 次 發 現 與 賴 氨 酸 連 接 的 乙 酰 基 是 在 一 項 對 組 蛋 白 修 飾 的研 究 中 (Jenuwein andAIlis，2001)。組 蛋 白 乙 酰 化 水 平 增 高 通 常 與 基 因 轉 錄 的 局 部 激 活有 關 (Zhang et al. ，2002)。而 組 蛋 白 賴 氨 酸 甲 基 化 則 集 中 于 被 抑 制 基 因 的 啟 動 子 區 域(Berger，2007)。研 究 發 現 ，乙 酰 化 是 動 態 可 逆 的 ，而 甲 基 化 更 穩 定 而 且 「長 壽 」（Bernstein and Allis， 2005)。 盡 管 大 量 研 究 都 集 中 在 這 些 組 蛋 白 上 的 P T M ，但 甲 基 化 和 乙 酰化 修 飾 在 許 多 蛋 白 質 上 都 會 發 生（Glozak et a L ，2005; Grewal and Rice，2004; Sadoul
e t a L , 2008; Y a n g and Seto, 2008)。在 真 核 生 物 中 ，N 端 乙 酰 化 是 最 常 見 的 P T M 之一 ，大 約 8 5 % 真 核 蛋 白 都 會 發 生（Polevoda and S h e r m a n , 2000)。第 一 個 發 現 的 被 乙 酰化 和 去 乙 酰 化 調 節 的 非 組 蛋 白 是 p5 3 蛋 白（G u and Roeder, 1997)。
與 許 多 其 他 P T M — 樣 ，傳 統 的 鑒 定 甲 基 化 和 乙 酰 化 的 方 法 是 利 用 能 識 別 修 飾 的 特異 性 抗 體 (antibody)。但 是 這 個 方 法 受 限 于 免 疫 方 法 相 關 的 交 叉 反 應 以 及 特 異 性 問 題 。關 于 組 蛋 白 ，有 一 些 從 細 胞 核 中 選 擇 性 分 離 的 方 法 (Garcia et al. ， 2007)。 更 通 用 的 鑒 定甲 基 化 和 乙 酰 化 位 點 的 方 法 是 利 用 體 外 放 射 性 標 記 分 析 。這 一 技 術 利 用 了 乙 酰 基 轉 移 酶或 甲 基 轉 移 酶 來 催 化 加 成 放 射 性 乙 酰 基 或 甲 基 供 體 。薄 層 色 譜 法 (T L C )或 H P L C 分離之 后 進 行 微 量 測 序 ，能 夠 揭 示 放 射 性 標 記 氨 基 酸 (Sobel et al. , 1994)。這 種 放 射 性 標 記方 法 有 它 的 缺 陷 ，它 需 要 的 純 的 起 始 材 料 量 非 常 高 ，并 需 要 使 用 放 射 性 檢 測 修 飾 氨基 酸 。
目 前 沒 有 一 種 有 效 的 方 法 能 夠 選 擇 性 富 集 甲 基 化 或 乙 酰 化 修 飾 的 肽 段 或 蛋 白 質 。另外 ，由 于 甲 基 化 和 乙 酰 化 發 生 在 堿 性 殘 基 上 ，在 利 用 胰 酶 作 為 蛋 白 酶 時 進 行 酶 切 的 效 率 較低 。尤 其 對 于 甲 基 化 修 飾 這 一 問 題 更 為 嚴 重 ，因 為 堿 性 殘 基 可 能 在 多 個 胺 位 點 發 生 甲 基化 。要 克 服 這 個 問 題 比 較 簡 單 的 選 擇 就 是 使 用 另 外 的 蛋 白 酶 。然 而 ，丟 失 的 胰 蛋 白 酶 切位 點 也 可 能 給 研 究 者 提 供 了 幫 助 ，它 可 以 作 為 一 個 指 示 以 說 明 該 位 點 可 能 發 生 了 修 飾 。串 聯 質 譜 搜 索 算 法 能 夠 考 慮 到 乙 酰 化 和 甲 基 化 修 飾 分 別 帶 來 的 42 D a 和 14 D a 的平 均 質量 漂 移 和 28 D a 雙 甲 基 化 質 量 漂 移 以 及 42 D a 的 三 甲 基 化 質 量 漂 移 。 由 于 三 甲 基 化 和 乙酰 化 肽 之 間 的 質 量 漂 移 僅 相 差 0.0363 D a ，因 此 在 研 究 三 甲 基 化 時 可 能 發 生 錯 讀 。利用 一 個 質 量 精 確 度 和 分 辨 率 足 夠 高 的 質 譜 儀 可 以 分 辨 這 一 質 量 差 異（Zhang et al. ,2 0 0 4 ) 。
另 一 個 鑒 定 乙 酰 化 和 甲 基 化 的 診 斷 工 具 是 分 析 C I D 類 型 質 譜 中 產 生 的 亞 胺（i m m o -n i u m ) 離 子 。含 有 未 修 飾 賴 氨 酸 的 肽 段 通 常 在 8 ? ? ‘ 處 產 生 一 個 特 征 性 的 亞 胺 離 子 峰(Trelle and Jensen, 2007)。當 賴 氨 酸 發 生 修 飾 時 , 會 形 成 一 個 不 同 的 具 有 獨 特 W z 值亞胺 離 子（圖 40. 3 ) 。受 限 于 發 生 的 重 排 反 應（rearrangement reaction), 無 法 形 成 雙 甲 基 或三 甲 基 化 形 式 的 亞 胺 。然 而 ，三 甲 基 形 式 會 產 生 一 個 獨 特 的 中 性 丟 失 碎 片 ，與 前 體 相 比 少了 59 D a , 這 是 由 于 丟 失 了 一 個 三 甲 胺 (Zhang et al. ，2004)。圖 40. 3 展 示 了 發 生 的 重 排反 應 ，以 及 不 同 亞 胺 離 子 及 其 相 應 的 值 。這些獨特 的 鑒 別 特 征 僅 能 通 過 C I D 質產獲得。