2.1 磷酸化
絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸殘基的可逆磷酸化也許是研究最為深人的 PT M 。蛋白質磷酸化信號網絡介導細胞對與不同的應激因子、生長因子、細胞因子以及細胞間相互作用作出響應。憐酸化還影響多種細胞進程，如增殖、凋亡 、遷移 、轉錄和蛋白質翻譯（W hite，2008)。 在腫瘤、自身免疫疾病、代謝紊亂和傳染性疾病中都涉及蛋白激酶和磷酸酶的異常調節（Blume-Jensen and H unter， 2001; Gatzka and Walsh， 2007; Sirard et al. ， 2007;T aniguchietaL ,2006)。一個磷酸化反應事件就會對細胞進程產生劇烈影響。例如, 養分剝奪、環境應激、某 些 小 R N A 病毒感染都會激發 eIF4E-結合蛋白的去磷酸化，進而導致 eIF4E-結合活性顯著提高, 從而抑制翻譯(Gingras et al. , 2001)。
傳統的鑒定磷酸化位點的手段包括使用32P-標 記的 ATP(32P-Iabeled ATP) 或磷酸共培養細胞。磷酸化蛋白質組會攝取生長培養基中的放射性磷, 繼而通過一些手段，如 2I>GE或高效液相色譜 (HPLC) 檢測具有放射性的蛋白質。分離得到的蛋白質會被水解。所得的磷酸肽在 TLC 板中分離，隨后利用 Edman 降解法進行測序。然而，這些方法非常費時，并需要大量相對純的磷酸肽，而且必需使用大量放射性材料 (McLachlin and Chait，2001)。
由于以上缺陷，基于質譜的蛋白質組學迅速崛起，成為鑒定磷酸化的首選方法。近期—個 蛋 白 質 組 研 究 通 過 比 較 大 腸 桿 菌 co「）、乳酸菌< X ac(ococo? Zac汾）和枯草 芽 孢 桿 菌 )發現, 在介導碳代謝作用的糖酵解途徑中的幾乎所有的酶都在不同的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基發生了磷酸化 (SouH et al. , 2008)。 有趣的是，他們還發現檢測出的磷酸化位點表現出的進化保守性遠遠高 于 一 級 序 列（Soufi et al. ，2008 ) 。 另一個研究小鼠肝臟磷酸化蛋白質組的結果發現，雖然鑒定出的許多磷酸化位點在 Swiss-P ro t數據庫中已有注釋(Pan et al. ， 2008)，然而鑒定位點中半數以上是新的，說明小鼠磷酸化蛋白質組中可能仍有許多磷酸化位點有待發現(Pan et al. , 2008)。
質譜法能夠從復雜的蛋白質混合物中鑒定出特定的磷酸化位點，但是這種方法也確實會有一些問題，如在樣品量有限、樣品復雜度高或樣品中蛋白質濃度動態范圍廣的蛋白質組學應用中時(White, 2008)。而將這些困難更為復雜化的是，磷酸化通常是亞化學計量 的 ，因 此 一 個 蛋 白 質 來 源 的 磷 酸 肽 的 濃 度 比 其 他 肽 段 的 濃 度 都 要 低 。大 量 未 修 飾 肽 段抑 制 了 質 譜 對 憐 fe膚 的 反應。. 這 個 現 象 會 導 致 目 的 憐 酸 膚 檢 測 信 號 的 缺 失（McLachlinand C h a k , 2001)。這 可 以 通 過 多 種 富 集 技 術 減 少 與 P T M 變 體 相 關 的 未 修 飾 肽 段 含 量 ，從 而 減 少 這 種 抑 制 性 假 象 (suppression artifact) 。
其 中 一 種 應 用 于 憐 酸 化 鑒 定 的 帛 集 技 術 是 使 用 強 陽 離 子 交 換（strong cationexchange,S C X )樹脂來選擇性分離磷酸肽。研究發現, 在 p H 小 于 2.6 時 ，胰蛋白酶消化的磷酸肽不能被S C X 顆 粒 保 留（BeausoleiletaL , 2004)，這可能是由于磷酸基團荷載了更 多 的負電特性。 S C X 柱的流穿液可以用反相(R P )色譜柱分離，并用質譜分析 (Lim andKassel， 2006)。這種將磷酸肽從未修飾的相似物中分離出來的方法, 可以幫助減輕上述的質譜檢測中的抑制問題。這種富集技術的優勢在于既能在線（on— line)也能離線（offline)分離 。而劣勢之一是它依賴于 S C X 樹脂與磷酸肽的不可結合性 ，這點與其他一些通過與磷酸化殘基結合，并因而能夠選擇性地富集磷酸肽的方法不同。
固定化金屬親和層析 (I M A C )是一種運用最為普遍的從復雜的消化蛋白質混合物中選擇性分離磷酸肽的方法。這種方法通常利用一種金屬螯合介質來結合三價金屬離子，如 Fe34或 G a 3+ ( S y k o r a et al. ，2007)。這種帶電樹脂結合磷酸肽后, 先用洗滌液(通常是乙酸溶液)去除未修飾肽段，接下來可用磷酸鹽緩沖液或者高p H 溶液洗脫磷酸肽。洗脫
的磷酸肽可直接過R P 柱脫鹽用于下一步質譜分析，也可離線進行進一步富集或其他操作 。 然 而 ，I M A C 法確實存在一些復雜因素。如果攜帶多磷酸化位點的磷酸肽豐度較大，它們會覆蓋 I M A C 樹脂，導致單磷酸化或雙磷酸化的磷脂肽保留較少。并且, 其他酸性肽段也會與 I M A C 柱發生親和作用, 從而與鱗酸肽一起被富集。這一問題在應用于極度復雜的肽混合物(如全細胞提取物) 時會更加嚴重。為了避免該問題, 許多研究者試圖通
過化學還原反應來甲基酯化酸性殘基和C 端 (Ficarro et al. ，2 0 0 2 ) 。 然而 ，研究發現甲基酯化反應并不是定量的（Cirulli et al. ，2 0 0 8 ) 。 這 樣 ，目的肽段的存在形式將是修飾過 、部分修飾或未修飾3 種 。這增加了混合物的復雜程度, 給定肽段的相對量實際上減少了（Cirulli et al. ，2 0 0 8 ) 。
另外一種類似于IM A C法的方法，使用二氧化鈦(TiO2)作為金屬螯合樹脂的替代物(Larsen et al.，2005; Pinkse et al. ，2004; Thingholm et al. ， 2006)。正如 IM A C法中修飾肽段的磷酸基團與H 價金屬有親和力一樣，在酸性條件下磷酸基團同樣與二氧化鈦分子有親和作用（Larsen et al.，2〇05; Pinkse et al. ，2004 ; Thingholm et al. ， 2006)。通過轉換到高P H 緩沖液中，磷 酸 肽 可 以 從 TiO2基質中洗脫下來。這種方法的優點在于 ，柱制備時間短，比 IM A X樹脂洗滌循環數少。研究表明, 盡管這兩種方法使用同樣的親和原理，但是它們卻具有互補性—兩種方法分別能夠檢測到不同磷酸肽（Cantiri et
al.，2007)。 IM A C 的特點是針對多磷酸化位點的肽段具備高親和力，而二氧化鈦則優先結合單憐酸化多肽 (Bodenmiller， e ta l. ，2007)。這表明在一個研究中同時使用兩種方法能夠最大限度覆蓋憐酸化蛋白質組。
另外一類磷酸肽富集方法則利用化學方法在磷酸化位點引入親和標簽（Goshe etal.，2001; Oda e ta l. ， 2001)。 該方法利用堿性環境，通過卩-消除反應從磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸殘基中去除 H 3PO4 (McLachlin andChait，2003; Oda et al. ， 2001); 進而通過
Michael-like加 成 反 應 ，將 一 個 二 巰 基 化 物 加 到 雙 鍵 上 ; 接 著 用 結 合 了 生 物 素 的 烷 化 試 劑處 理 巰 基 ，得 到 的 生 物 素 化 肽 段 可 利 用 親 和 素 柱 色 譜 來 富 集（圖 40.1) (McLachlin andChait，2003)。這 個 方 法 的 一 個 難 點 在 于 ，由 于 生 物 素 與 親 和 素 間 的 高 親 和 力 ，回 收 標 簽化 的 肽 段 成 為 問 題 。并 且 ，這 個 方 法 能 夠 富 集 磷 酸 絲 氨 酸 、磷 酸 蘇 氨 酸 ，卻 無 法 富 集 磷 酸酪 氨 酸 。片 消 除 反 應 后 接 michael 加 成 反 應 同 樣 會 改 變 O 聯 片 JV-乙 酰 葡 糖 胺（O-
G l c N A c )修飾，這樣會與磷酸化競爭富集作用 (W e lls e t al. ，2002)。最 后 ，在 , 消 除 反 應的堿性環境下，會發生不需要的副反應，導致對肽段質量造成無法預料的影響，從而使下游的肽段質譜鑒定變得更加困難。
在質譜過程中，必須考慮磷蛋白的特定化學性質。發 生 在 S 或 T 氨基酸上的磷酸化是不穩定的。傳 統 的 斷 裂 方 法 會 導 致 磷 酸 絲 氨 酸 和 磷 酸 蘇 氨 酸 殘 基 發 生 H 3PO4 , 或HPO3選擇性中性丟失，并且先于肽鍵的斷裂絕大部分憐酸化修飾都發生了片消除反應，僅 有 一小部分憐酸化修飾伴隨著肽鏈斷裂而保留下來（Bennett et al. , 2002; L e e et al. ，2001; M a et al. ，2001)。這會造成質量譜圖中包含的測序離子變少，而且通常這些離子強度會變弱。最終較低的信噪比（圖 40. 2)會妨礙對肽段序列的解釋。盡管磷酸酪氨酸也可能丟失磷酸基團，但是很少像磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸殘基一樣產生強烈的中性丟失離子。一些質譜儀使用 E T D 避免這種中性丟失問題，產生的譜圖既適合于序列分析也適合于憐酸化殘基測定。我們在介紹用于蛋白質組學鑒定P T M 的設備時，將會進一步討論這種斷裂方法。
另外，中性丟失偽跡(neutral loss artifact)也 可 為 研究人員提供便利。中性丟失跡象是肽段中含有磷酸化位點的一個顯著的指示信號。質譜中觀察到的中性丟失峰通常由于其形成的優先性而具有高強度。因此，如果對于+ 1 價電荷肽段，發現前體離子丟失98 m /z(H3P4)或 80 m/z (H P0 3)，可以推斷在肽段序列中存在一個磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸殘 基 。 現代質譜儀可以監測這種質量丟失。離子阱質譜儀能夠分離中性丟失碎片，并開始另一輪 斷 裂（MS3 scan) (Beausoleil et al. ，2004; Gruhler et al. ，2005; Olsen and Mann， 2004 ; Ulintzetal. ，2009)。 這個附加分析步驟的結果就是提供了額外的序列覆蓋 范 圍 ，從而幫助鑒定磷酸肽，并 將 P T M 匹配到特定氨基酸。另外 一 種 MS3? 描 的替代方 法就是運用于離子阱質 譜 儀 的磷酸肽斷裂「Pseudo MS」」或稱多級活化（M SA)(SChro e d e re ta l. ，2004)。這種方 法 在 M S /M S掃描肽段產生的中性丟失產物引入了 C I D 。 中性丟失離子產生的離子與初始MS/M S 產物離子一起被捕獲得到復合譜。在 M S A 中 ，中性丟失離子被轉變成一些結構上有益的碎片離子，這種離子在數據庫搜索算法中的分數將會出現升高現象(Schroeder et al. ，2004; Ulintz et al. ，2009)。
磷 酸 化 給 肽 段 引 入 一 個 負 電 荷 ，這 也 將 影 響 質 譜 的 分 析 。當 陽 離 子 模 式 下 操 作 時 ，這個 負 電 荷 會 減 弱 質 譜 儀 響 應 (McLachlin and Chait，2001)，這 會 導 致 譜 圖 質 量 變 差 ，并 使磷 酸 肽 鑒 定 更 加 困 難 。而 且 ，增 加 的 負 電 荷 會 降 低 質 譜 分 析 前 蛋 白 質 混 合 物 制 備 時 的 蛋白 質 水 解 作 用 。然 而 需 要 說 明 的 一 點 是 ，Harnio Steen與 同 事 發 現 , 在 使 用 電 噴 霧 電 離(electrospray ionization,ESI)選 擇 性 研 究 磷 酸 肽 時 , 沒 有 證 據 能 證 明 電 離 程 度 /探 測 效 率會 降 低（Steen et al. ，2006)。
作 為 一 種 替 代 方 法 ，Steve C a r r 和 同 事 提 出 了 前 體 離 子 掃 描 (precursor ion scanning)技 術 ，可 以 用 來 避 免 陽 離 子 模 式 運 行 質 譜 時 產 生 的 一 些 問 題 (Carr etal. ，1996)。 串 聯 質譜 是 在 陰 離 子 模 式 下 運 行 ，并 且 磷 酸 化 殘 基 會 產 生 特 征 性 的 碎 片 :P O 3— 大 小 為 一 79 D a ，P O 2— 大 小 為 一 63 D a 。當 在 前 體 離 子 掃 描 中 發 現 以 上 事 件 中 任 何 一 個 時 ，將 會 對 前 體 離子 進 行 M S /M S 檢 測（Z a p p a c o s t a e t a L，2006)。這 種 方 法 檢 測 磷 酸 肽 時 比 陽 離 子 模 式質 譜 靈 敏 度 更 高 (Carret a L ，1M 6) 。然 而 ，陰 離 子 譜 解 釋 較 為 困 難 ，因 此 并 未 得 到 廣 泛
2.2 糖基化
糖 基 化 是 一 種 常 見 的 P T M , 并 且 已 經 證 明 能 夠 影 響 酶 的 活 性 、蛋 白 質 定 位 、穩 定 性 、信 號 轉 導 、細 胞 黏 附 和 蛋 白 質 相 互 作 用 (Spiro, 2002k 目 前 已 經 發 現 在 腫 瘤 惡 性 轉 化 和腫 瘤 發 生 時 ，生 物 體 液 中 蛋 白 質 和 細 胞 表 面 的 糖 基 化 模 式 會 發 生 變 化 (Durand and Seta,2000)。一 個 蛋 白 質 組 中 存 在 著 大 量 糖 基 化 修 飾 。O- 糖 基 化 蛋 白 質 是 在 絲 氨 酸 和 蘇 氨 酸位 點 發 生 修 飾 , 而 C -糖 基 化 則 靶 向 于 色 氨 酸 ,N-糖 基 化 靶 向 天 冬 酰 胺 。發 生 N -糖 基 化 的蛋 白 質 會 有 一 些 共 同 之 處 ，如 核 心 結 構 、一 些 去 除 N 聯 結 構 的 酶 ，并 且 普 遍 分 布 在 細 胞 膜胞 外 區域（Medzihradszky, 2005 ) 。 N-糖 基 化 位 點 有 一 個 確 定 的 共 有 序 列（consensussequence) ,即N-X-S/T ,X 是除脯氨酸之夕卜的任何氨基酸(Pless and Lennarz, 1977)。另— 個 靶 向 絲 氨 酸 和 蘇 氨 酸 殘 基 的 修 飾 是 O聯β-N-乙 酰 葡 糖 胺 (O G k N A c ) 。 Gerald Hart和 同 事 開 創 了 這 種 動 態 核 質（nucleocytoplasmic) P T M 研 究 的 先 河（Holt and Hart,1986)。發 生 這 種 修 飾 的 許 多 靶 向 蛋 白 質 也 能 夠 發 生 磷 酸 化 修 飾 ，推 測 這 種 修 飾 對 蛋 白質 磷 酸 化 修 飾 會 有 拮 抗 作 用 ( A h m a d et aL , 2006)。
質 譜 鑒 定 磷 酸 化 的 一 些 問 題 同 樣 也 出 現 在 糖 基 化 研 究 中 。相 對 未 被 修 飾 的 蛋 白 質 ，這 些 修 飾 在 豐 度 上 都 傾 向 于 亞 化 學 計 量 。蛋 白 質 糖 基 化 和 O G l c N A c 修 飾 在 質 譜 中 都 是不 穩 定 的 ，通 常 產 生 低 質 量 的 測 序 譜 圖 。盡 管 N -糖 基 化 的 一 種 共 有 序 列 已 經 非 常 明 確 ，然 而 在 體 內 僅 有 部 分 含 有 這 一 共 有 序 列 的 蛋 白 質 發 生 了 糖 基 化 。
上 面 提 到 的 可 應 用 于 磷 酸 化 分 析 的 替 代 的 肽 段 斷 裂 方 法 同 樣 適 用 于 糖 基 化 。能夠解決 糖 基 化 低 豐 度 問 題 的 富 集 技 術 也 已 存 在 (Mechref e t a L ，2008)。使 用 凝 集 素 親 和 層 析(lectin affinity chromatography) 可 選 擇 性 地 富 集 糖 蛋 白 。凝 集 素 是 一 種 高 度 特 異 的 糖 結合 蛋 白 ，并 能 夠 與 固 相 基 質 偶 聯 . 偶 聯 好 的 樹 脂 與 復 雜 的 水 解 蛋 白 質 混 合 物 混 合 ，通 過 洗滌 、洗 脫 即 可 分 離 到 適 用 于 蛋 白 質 組 學 分 析 的 糖 肽 組 分 。 O G l c N A c 可 用 P-消 除 法 及 后續 的 Michael加 成 二 硫 蘇 糖 醇 或 生 物 素 -戊 胺 (biotin pentylamine)反 應 來 富 集 ，這 種 方 法類 似 于 前 文 磷 酸 化 中 所 詳 述 的 內 容 (Wells et al. ，2002)。另 一 種 方 法 是 N -聯 糖 肽 固 相提 取 法（solid-phase extraction of N-Iinked glycopeptides，S P E G ), 這 種 方 法 使 用 肼 化 學法 (hydrazine chemistry)直 接 將 糖 肽 添 加 到 固 相 支 架 上 (Tian et al. ，2007)。洗 漆 后 ，用肽 -N -糖 苷 酶 (peptide-iV-glycosidase)處 理 來 洗 脫 糖 肽 。凝 集 素 親 和 層 析 色 譜 法 的 優 點 在于 ，能 夠 結 合 的 糖 蛋 白 范 圍 非 常 廣 , 通 過 不 同 糖 苷 酶 洗 脫 能 夠 有 效 分 離 不 同 類 型 的 糖 肽(Yang and H a n c o c k , 2005)。也 有 專 門 的 柱 子 ，所包含 的 凝 集 素 特 異 地 結 合 一 定 類 型 的糖 連 接 結 構 ，能 提 供 更 高 不 同 程 度 的 選 擇 性 富 集（Tian et al. , 2007)。需 要 說 明 的 是 , 使用 糖 苷 酶 詵 脫 糖 肽 是 從 肽 段 上 切 下 寡 糖 ，這 使 得 原 本 可 以 通 過 質 譜 獲 得 的 結 構 信 息 丟 失 。但 是 這 卻 大 大 簡 化 了 數 據 分 析 過 程 , 因 為 糖 基 化 的 天 然 結 構 非 常 復 雜 ，并 且 以 多 變 的 聚 糖基 化 (polyglycosylated)形 式 存 在 。
2.3 泛素化和蘇素化修飾
泛 素 是 一 個 由 7 6 個 氨 基 酸 組 成 的 蛋 白 質 ，能 夠 通 過 其 C 端 的 甘 氨 酸 殘 基 結 合 于 底物 賴 氨 酸 的 α氨 基 基 團 。這 個 過 程 需 要 E 1 、E 2 、E 3 酶 共 同 參 與（Fang and W e i s s m a n ,2004)。泛 素 的 序 列 含 有 7 個 賴 氨 酸 , 這 7 個 賴 氨 酸 能 夠 被 泛 素 化 選 擇 ，從 而 形 成 泛 素 鏈(Fang and W e i s s m a n ，2004)。被 進 一 步 泛 素 化 的 泛 素 分 子 內 部 的 賴 氨 酸 能 夠 決 定 泛 素化 修 飾 的 生 物 學 意 義 。例 如 ，K 4 8 連 接 的 泛 素 鏈 能 引 導 被 修 飾 蛋 白 質 經 由 26S 蛋 白 酶 體降 解 , 而 K 6 3 的 連 接 形 式 則 參 與 到 D N A 損 傷 反 應 、蛋 白 質 運 輸 、N F -KB 信 號 通 路 的 信 號轉 導 等 過 程 (Ikeda and Dikic，2008; Pickart and F u s h m a n ，2004)。泛 素 化 蛋 白 的 周 轉 非常 迅 速 ，這 導 致 這 種 P T M 處 于 低 穩 態 水 平 (Peng etal. ，2003)。而 使 泛 素 化 位 點 的 預 測更 加 復 雜 化 的 是 , 幾 乎 沒 有 數 據 能 夠 證 明 泛 素 化 存 在 一 個 通 用 基 序 (SUter etal. , 2008)。
另 一 個 類 似 泛 素 的 小 蛋 白 質 分 子 就 是 蘇 素 化 修 飾 蛋 白（S U M O ) 。盡 管 兩 種 蛋 白 質一 致 性 僅 1 8 % , 但 是 它 們 的 三 維 結 構 卻 有 相 似 性 (Bayer et al. ，1998)。蘇 素 化 修 飾 和 泛素 化 共 享 相 同 的 E 1 、E 2 、E 3 酶 , 將 S U M O 分 子 結 合 到 一 個 保 守 基 序 內 部 的 氨 基 酸 殘 基上 。蘇 素 化 修 飾 優 先 發 生 在 女 K -X -E 序 列 中 ，^ 代 表 一 個 疏 水 性 氨 基 酸（Rodriguez etal. ，2001)。蘇 素 化 修 飾 靶 向 于 大 量 參 與 各 種 不 同 細 胞 進 程 的 蛋 白 質 , 如 轉 錄 調 節 、核 小體 形 成 、細 胞 核 孔 復 合 物 和 D N A 修 復 (Melchior et a L ，2003)。蘇 素 化 修 飾 能 夠 與 泛 素化 競 爭 ，從 而 阻 止 蛋 白 質 被 降 解 , 穩 定 細 胞 所 需 的 關 鍵 的 酶 。這 種 修 飾 還 能 夠 將 蛋 白 質 進行 特 定 的 細 胞 定 位 , 如 核 孔 復 合 體 (M anza et al. ，2004)。
目 前 已 經 發 展 了 一 些 有 效 的 富 集 方 法 來 分 離 泛 素 化 和 其 他 蘇 素 化 修 飾 的 蛋 白 質 。其中 最 成 功 的 一 種 是 在 泛 素 及 類 泛 素 分 子 的 基 因 序 列 中 整 合 人 氨 基 末 端 表 位 標 簽（aminoterminal epitope t a g K P e n g et al. ， 2003; Tagwerker et al. ， 2006)。 目 前 已 成 功 使 用 了多 組 氨 酸 標 簽 ，以 及 由 多 組 氨 酸 標 簽 和 F L A G 標 簽 組 成 的 串 聯 親 和 標 簽 (C h a n g , 2006)。串 聯 親 和 標 簽 純 化 方 法 能 夠 減 少 假 陽 性 的 出 現 率 ，但 是 無 法 完 全 消 除 。使 用 抗 泛 素 類 分子 的 抗 體 是 一 種 選 擇 , 但 是 這 種 抗 體 應 用 于 免 疫 沉 淀 中 以 分 離 泛 素 蛋 白 質 的 方 法 仍 在 發展 中 。也 可 利 用 泛 素 結 合 蛋 白 質 以 避 免 一 些 由 抗 體 和 親 和 標 簽 引 起 的 問 題 (Kirkpatricketal. ，2005)。表 位 標 簽 在 簡 單 模 式 系 統 ，如 釀 酒 酵 母 (Sacc/iarom^ ycescereTO’ h a e ) 中應用非 常 方 便 ，因 為 編 碼 未 標 簽 泛 素 的 多 個 基 因 可 被 刪 除 ，使 得 細 胞 中 僅 有 含 表 位 標 簽 的 泛 素分 子 。
事 實 上 ，泛 素 化 和 蘇 素 化 修 飾 都 是 蛋 白 質 類 P T M , 可 采 用 多 種 質 譜 的 手 段 鑒 定 靶 蛋白 。當 胰 酶 消 化 泛 素 化 蛋 白 質 時 ，部 分 泛 素 分 子 被 切 割 下 來 。剩下胰 蛋 白 酶 消 化 片 段 的泛 素 化 位 點 上 含 有 2 個 甘 氨 酸 殘 基 ，通 過 一 個 異 肽 鍵 與 賴 氨 酸 相 連（P eng et a L ，2003)。這 一 肽 段 導 致 在 賴 氨 酸 殘 基 處 產 生 了 一 個 114 D a 的 標 稱 質 量 漂 移 ，而 且 由 于 胰 蛋 白 酶 不能 識 別 修 飾 過 的 賴 氨 酸 ，因 而 還 丟 失 了 一 個 胰 蛋 白 酶 酶 切 位 點 。對 于 其 他 蘇 素 化 修 飾 也有 各 自 特 征 性 的 質 量 漂 移 , 見 表 40. 2(D enis〇n et al. ， 2005)。當 搜 索 譜 圖 尋 找 該 類 型 的潛 在 P T M 時 ，可 以 考 慮 這 些 特 性 。
使 用 基 于 質 譜 的 蛋 白 質 組 學 方 法 研 究 此 類 P T M 的 一 個 顯 而 易 見 的 問 題 就 是 質 量 S移 (mass shift) 的 冗 余 ，如 表 40. 2 所 示 。從 一 個 肽 的 鑒 定 譜 圖 中 可 能 無 法 分 辨 這 是 泛 素化 修 飾 還 是 蘇 素 化 修 飾 ，因 為 這 兩 種 類 型 都 能 在 賴 氨 酸 殘 基 處 增 加 114 D a 。蘇 素 化 修 飾會 使 肽 段 質 量 增 加 較 大 ，這 會 影 響 肽 段 的 電 離 ，減 弱 電 離 效 率 。發 生 蘇 素 化 修 飾 肽 段 會 使結 果 譜 圖 變 復 雜 ，甚 至 無 法 解 讀 。 一 個 實 驗 室 發 展 了 蘇 素 化 修 飾 模 式 識 別 軟 件（S U M -m 〇n ) ，來 尋 找 由 復 雜 P T M 產 生 的 碎 片 離 子 模 式 ，并 鑒 定 修 飾 肽 段 及 其 相 應 的 修 飾 位 點