1、攝入量不足：羊乳含葉酸量低，牛乳制品如奶粉、蒸發乳經加熱等處理后，所含葉酸亦遭致破壞，故單純用這類乳品喂養嬰兒而未及時添加輔食就容易發生本癥。由于胎兒可從母體得到葉酸并貯存于肝，故出生后4個月之內一般不會發病，此癥的高峰年齡是4~7個月。
2、藥物作用：正常結腸內細菌含有葉酸，可被吸收以供人體之需，長期服用廣譜抗生素可使結腸內部分細菌被清除，因而影響葉酸的供應。長期使用抗葉酸制劑（如氨甲蝶呤）者，因其可抑制葉酸還原煤酶、阻抑葉酸轉變為四氫葉酸，因而致病。此外，長期服用某些抗癲癇藥（如苯妥英鈉、撲撲癇酮、苯巴比妥）也可導致葉酸缺乏，可能是由于抗癲癇藥物引起葉酸吸收障礙，或是藥物置換了血清中運輸葉酸的載體所致。
3、代謝障礙：慢性腹瀉、脂肪下痢等均可影響葉酸吸收而致缺乏。先天性葉酸代謝障礙見于一種小腸吸收葉酸缺陷及葉酸轉運功能障礙的先天性疾病，除呈現大細胞性貧血外，尚有驚厥、智力發育遲滯和腦鈣化。缺乏葉酸所致的小兒巨幼紅細胞性貧血的診斷根據貧血癥狀、血象改變和骨髓中發現巨幼紅細胞即可診斷為巨幼紅細胞性貧血；在形態學診斷基礎上進一步測定血清葉酸，如含量降低而血清維生素B12含量正常，即可診斷。在嚴重貧血時，患者可因缺氧而出現一些精神神經癥狀，易與維生素B12缺乏所致的巨幼紅細胞性貧混淆，在無條件測定血清葉酸含量時，可作“小劑量葉酸治療試驗”，方法為：每天口服葉酸0.125mg，或肌注1mg，如為葉酸缺乏者，則其網織紅細胞于給藥2~4天后增加，臨床癥狀、血象和骨髓象也隨之改善，而對維生素B12缺乏者則無效。