縮短蛋白質療法的上游生物工藝時間（二）

  案例研究
    克隆篩選和早期工藝開發
    為了使自動化微型生物反應器成為可行的克隆選擇和早期工藝開發模型，微型生物反應器培養的工藝參數、細胞增長和活性結果應與臺式生物反應器的結果相似。為了確定這一點，用ambr15自動化微型生物反應器(3個復制品)、1L和3L玻璃臺式生物反應器進行了比較。
    為了檢測活細胞數(VCC)，在微型生物反應器、一個3L玻璃生物反應器(Applikon)或1L的DASGIP?生物反應器(Eppendorf)中采用補料分批工藝培養三個表達單克隆抗體的指定K1-3CHO克隆。在ZL細胞培養條件下培養細胞系10至14天。按照0.5x106活細胞/毫升接種培養物，每24小時取樣，用于1L和3L生物反應器，每48至72小時取樣，用于ambr生物反應器、離線pH、細胞數和代謝物測量。用Vi-CELL細胞活力分析儀(貝克曼庫爾特)計算活細胞數(VCC)，在Vi-CELL測量前，用PBS緩沖液稀釋(1:3vol/vol)來自微細生物反應器(0.25mL)的細胞，以減少取樣容積。測量效價，用血氣分析儀(西門子)測量pH、pCO2和DO的離線測量值，用NOVA 400(諾瓦生物醫學)測量代謝物，例如葡萄糖、乳酸鹽、谷氨酸鹽、谷氨酸酯。
    細胞增長和生產率結果表明(圖3和4)，在1L、3L臺式生物反應器或ambr15自動化微型生物反應器中培養的三個CHO克隆均呈現相似的增長和效價曲線。

圖3 在ambr15和3L玻璃生物反應器中培養的三個CHO克隆的生長和蛋白質表達曲線比較

圖4 在ambr15和1L玻璃生物反應器中培養的三個CHO克隆的生長和蛋白表達曲線比較

    細胞代謝結果(圖5)表明，在1L臺式生物反應器或自動化微型生物反應器中培養的三個CHO克隆均呈現相似的pH和pCO2曲線。

圖5 在自動化微型生物反應器和1L玻璃生物反應器中培養的三個CHO克隆的細胞代謝曲線比較

    數據支持之前的文獻報告，ambr15微型生物反應器系統擁有高生產量，每次運行可使用24個微型生物反應器，能夠以復制的形式實現多個相同的并聯培養。使用手動控制的搖瓶或臺式器皿很難達到該生產量，并且需要投入大量時間和資源，還有使結果出現變異性的風險。
    工藝放大
    對于早期工藝開發，ambr15系統適合用于模擬臺式生物反應器條件，已發布的數據表明，ambr15可模擬2L至7L規模的臺式生物反應器。對于工藝放大，ambr15也可用作關鍵參數的比較模型，例如：更大型反應器中的細胞增長和生產率。有一份研究報告稱，在微型生物反應器、7L玻璃生物反應器(Applikon)、10L一次性生物反應器(通用電氣醫療集團生命科學部)和200L一次性BIOSTAT?STR生物反應器(賽多利斯)的補料分批工藝中培養了一個表達單克隆抗體的CHO細胞系。按照0.5×10⁵活細胞/毫升接種細胞，在ZL細胞培養條件下培養細胞。按需要添加葡萄糖，對培養物進行試驗11天。定期計算細胞數，進行最終收獲后，分析總蛋白的數量，結果(表2)表明各類型生物反應器中使用了類似范圍的效價。ambr15、7L玻璃生物反應器、10L一次性生物反應器和200L一次性生物反應器的增長曲線呈現較高的相似性(圖6)。

圖6 在ambr15、7L玻璃生物反應器、10L一次性生物反應器和200L一次性賽多利斯生物反應器中培養的CHO細胞系的增長曲線

    結合使用自動化微型和小型生物反應器系統可取代傳統的搖瓶和臺式生物反應器，并且優勢眾多：相對于圖4 在ambr15和1L玻璃生物反應器中培養的三個CHO克隆的生長和蛋白表達曲線比較手動密集型基于振動器的系統，可提升數據質量、降低風險；提高生物反應器生產量；大幅縮短工藝開發時間(圖7)；在工藝開發中研究更多的生物反應器條件(圖7)，從而提高工藝生產率和/或產品質量。

圖7 使用自動化微型和小型生物反應器的工藝開發

    結論
    ambr15自動化微型生物反應器系統準確模擬臺式生物反應器的培養環境，生成相似的細胞增長、細胞代謝和蛋白質生產的結果。本文表明，賽多利斯一次性生物反應器ambr15能夠為細胞的增長和活性放大到生產級別提供高度可能性。因此，這一微型生物反應器可取代搖瓶模型或傳統臺式反應器，在設置、操作、停工、清潔和殺菌工作中節約大量時間和金錢，同時仍保留擴展為大型生物反應器的可擴展性。由于該微型系統是全自動并且使用較小的細胞培養容積，科學家在相同的時間內可完成更多試驗，使用更少的資源，例如培養基或補料，使其成為用于早期工藝開發的經濟型高通量方法。
    結合使用自動化微型和小型生物反應器可取代傳統的搖瓶和臺式生物反應器。因此，生物工藝優化不再受到臺式生物反應器的可用性、操作員時間或基礎設施的限制，目前，ambr微型和小型生物反應器技術為減少蛋白質療法的開發時間和生產成本做出了巨大貢獻。