細菌細胞壁的染色法和細胞質膜的觀察

一、目的要求
　　1．學習掌握細菌  細胞壁的染色法。
　　2．利用質壁分離法觀察細菌的細胞壁和細胞質膜。
　　二、基本原理
　　細菌細胞壁很薄，革蘭氏陽性菌的細胞壁為20—30nm，革蘭氏陰性菌的細胞壁為10—13nm。組成細菌細胞壁的主要化學成分是肽聚糖，它與染料結合的能力差，不易著色，在細菌的染色過程中，一般情況染料都是通過細胞壁的滲透、擴散等作用而進入細胞，細胞壁本身并未染色，因此，欲通過染色來觀察細胞壁，必須設法使細胞壁能著色，而細胞質則不易著色，常用的方法有單寧酸法和磷鉬酸法。單寧酸和磷鉬酸都是起媒染作用，它們使細胞壁形成可著色的復合物，而使細胞質不易被著色，經結晶紫或甲基綠染色后，便可在普通光學顯微鏡下觀察到細胞壁。
　　根據細菌細胞在高滲溶液中或用乙醚蒸氣處理后，會產生質壁分離這一現象，經染色后也可在普通光學顯微鏡下區分細胞壁和細胞質膜。
　　三、器材
　　巨大芽孢桿菌（Bacillus megatherium），枯草芽孢桿菌；
　　0．2％結晶紫水溶液，5％單寧酸（鞣酸）水溶液，1％磷鉬酸水溶液，1％甲基綠水溶液，25％NaCl水溶液，0．01％結晶紫水溶液，Bouin氏固定液，0．1％硫堇（thionine）水溶液，乙醚，乙醚蒸氣瓶等。
　　四、操作步驟
　　1．單寧酸法
　　(1)將培養16—18小時的巨大芽孢桿菌按常法制成涂片。
　　(2)用5％單寧酸染5分鐘后，水洗。
　　(3)用0．2％結晶紫染3—5分鐘，水洗，吹干。用油鏡觀察，細胞壁呈紫色，細胞質呈淡紫色。
　　2．磷鉬酸法
　　(1)制備濃厚的涂片，在未干時浸入1％磷鉬酸水溶液3—5分鐘。
　　(2)用1％甲基綠水溶液染3—5分鐘。
　　(3)水洗后，吹干，用油鏡觀察。細胞壁為綠色，細胞質無色。
　　3．區分細胞壁與細胞質膜
　　(1)乙醚蒸氣法
　　(a)將巨大芽孢桿菌涂布于蓋玻片上，翻轉蓋玻片使其放在乙醚蒸氣瓶的瓶口上蒸3分鐘。
　　(b)取下蓋玻片置Bouin氏固定液中30分鐘后取出，水洗。
　　(c)用硫堇染色30秒鐘。
　　(d)水洗，水封，置油鏡下觀察。
　　(2)NaCl法
　　(a)取一滴25％NaCl溶液于潔凈的載玻片上。
　　(b)挑一小環培養6小時的枯草芽孢桿菌，在25％NaCl水滴中涂布均勻，待自然干燥。
　　(c)滴加0．01％結晶紫于其上，使蓋滿有菌部分，30秒鐘后水洗，干燥，用油鏡觀察結果。
　　五、實驗報告
　　1．結果
　　繪圖示細菌細胞壁與細胞質膜。
　　2．思考題
　　比較單寧酸法與磷鉬酸法、乙醚蒸汽法與NaCl法之間的異同，根據你所做的試驗認為哪種方法好？