細胞死亡的檢驗方式

細胞發生凋亡時具有固有的形態特征,如細胞核表現縮小、染色質邊緣化、凝集,凋亡晚期還會出現由核碎片與胞質內的部分細胞器混合在一起,且被細胞膜包裹形成的凋亡小體。
DNA特異性染料(如Hoechst33342、Hoechst33258和DAPI等)可以與DNA的A-T堿基區進行非嵌入式結合,從而使細胞核著色,在紫外光激發時會出現明顯的熒光。通過熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡可以觀察細胞染色質的形態學變化、膜結構及通透性的改變,從而鑒別凋亡細胞、正常細胞及壞死細胞。
細胞凋亡的形態學檢測結果直觀,至今仍是判定細胞是否發生凋亡的金標準,但觀察凋亡細胞的形態特征耗時費力,不適于大量凋亡樣本的檢測。
細胞凋亡的DNA化檢測
DNAladder
提取凋亡細胞的基因組DNA,經電泳后染色觀察可見180bp～200bp及其不同倍數的彌散狀DNA條帶,即DNAladder。DNAladder被視為經典的檢測細胞凋亡的指標,但DNA凝膠電泳特異性雖高而靈敏度偏低,不適于檢測ATCC細胞凋亡初期DNA鏈的輕微損傷。
TUNEL檢測法
TUNEL法是一種將分子生物學和免疫組織化學相結合的原位檢測凋亡細胞DNA的方法。
其基本原理為:細胞發生凋亡時核酸內切酶被激活,染色質或DNA被核酸內切酶切割后產生180bp～200bp的含3′-OH末端的片斷,脫氧核苷酸末端轉移酶將結合有熒光素的核苷酸(dUTP)標記到缺口3′-OH的末端,依次加入HRP抗熒光素抗體和HRP顯色底物DAB,凋亡細胞顯色明顯,而正常細胞沒有DNA斷裂或者只有少量的DNA發生斷裂,故不被顯色。
TUNEL法因其靈敏高而被廣泛用于各種凋亡細胞的檢測,由于在壞死細胞內也可能存在DNA,所以只有DNA鏈普遍斷裂才能證明細胞發生凋亡。另外,在TUNEL法具體試驗操作過程中,需要摸索細胞的固定及消化時間,以提高該技術的敏感性和獲得較低的背景值。
ELISA檢測法
應用ELISA方法也可以檢測DNA,在凋亡的早期DNA發生斷裂,核小體釋放進入細胞質中,核小體是染色質的基本單元,通過ELISA檢測凋亡細胞釋放到細胞質中的核小體從而確定細胞凋亡程度。
此方法既可定性又可以定量,而且適合檢測大批量樣本,不需要特殊的儀器。試驗過程中如果裂解細胞的時間過長可能導致細胞核中的DNA片段也被計算在內,進而導致結果偏高,因此不同的ATCC細胞系需要經過數次摸索才能確定zui佳檢測條件。