細胞因子的檢測方法

細胞因子的檢測方法

細胞因子（cytokine）是由細胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物質的統稱。在免疫應答過程中，細胞因子在免疫調節、炎癥應答、腫瘤轉移等生理和病理過程中起重要作用。細胞因子的檢測不僅是基礎免疫研究的有較手段，同時在臨床疾病診斷、病程觀察、療效判斷及細胞因子治療監測方面具有重要價值。

但是，由于細胞因子在體內的含量甚微，給細胞因子的檢測帶來困維，細胞因子的檢4．細胞病變抑制法

病毒可造成靶細胞的損傷，干擾素等則可抑制病毒所導致的細胞病變，因此可利用細胞病變抑制法檢測這類因子。

二、免疫學檢測法

細胞因子均為蛋白或多肽，具有較強的抗原性。隨著重組細胞因子的出現，可較方便地獲得細胞因子的特異性抗血清或單克隆抗體，因此可利用抗原抗體特異性反應的特性，用免疫學技術定量檢測細胞因子。盡管細胞因子種類繁多，只要獲得了針對某一因子的特異性抗體（包括多克隆抗體或單克隆抗體）均可采用相似的技術開展工作。常用的方法包括ELISA、RIA及免疫印跡法。目前，幾乎所有常見細胞因子的檢測試劑盒均有商品供應。此外還可利用酶標或熒光標記的抗細胞因子單克隆抗體，原位檢測因子在細胞內的合成及分布情況，如近來來發展起來的細胞內染色法和酶聯免疫斑點（ELISPOT）技術等。免疫學檢測法可直接測定樣品中特定細胞因子的含量（用ng/ml表示），為大規模檢測臨床病人血清中細胞因子的含量提供了方便。本法僅測定細胞因子的抗原性，與該因子活性不一定相平行，因此要了解細胞因子的生物學效應，必須結合生物學檢測法。

三、分子生物學方法

這是一類利用細胞因子的基因探針檢測特定細胞因子基因表達的技術。目前所有公認的細胞因子的基因均已克隆化，故能較容易地得到某一細胞因子的cDNA探針或根據已知的核苷酸序列人工合成寡聚核苷酸探針。利用基因探針檢測細胞因子mRNA表達的方法多種多樣，常使用斑點雜交、Northern blot、逆轉錄PCR，細胞或組織原位雜交等。實驗的關鍵在于制備高質量的核酸探針和獲得合格的待測物（提取的mRNA樣品或細胞/組織標本）。核酸探針是指一段用放射性同位素或其他標記物（如生物素、地高辛等）標記并與目的基因互補的DNA片段或單鏈DNA、RNA。根據其來源可分為cDNA探針、寡核核苷酸探針、基因組基因探針及DNA探針等。其中cDNA探針和人工合成寡核苷酸探針常用于斑點雜交及Northern blot，而RNA探針因穿透性好更適用于原位雜交。核酸探針技術的應用已經程序化，以cDNA探針為例主要包括：①質粒DNA的提取；②靶DNA片段的分離；③靶DNA片段標記；④待測樣品mrna的提取；⑤標記cDNA探針對待檢樣品的雜交；⑥放射自顯影或顯色分析。近年來出現的RT-PCR檢測特異性mRNA的方法也廣泛用于細胞因子研究領域。該法具有靈敏、快速等優點，甚至從1～10個細胞中就可檢出其中的特異mRNA。

上述三種方法，各有優缺點，可互相彌補，在實際應用中，可根據各自的實驗目的和實驗室條件進行選擇。生物學檢測法比較敏感，又可直接測定生物學功能，是zui可靠的方法，適用于各種實驗目的，是科研部門zui常用的技術，但需要長期培養依賴性細胞株，檢測耗時長，步驟繁雜，影響因素多，不容易熟練掌握。免疫學檢測法比較簡單，迅速，重復性好，但所測定的只代表相應細胞因子的量而不代表活性，同時敏感度也低于生物活性檢測法（約低10～100倍）。分子生物學法只能檢測基因表達情況，不能直接提供有關因子的濃度及活性等資料，主要用于機制探討。在檢測細胞因子時，必須考慮到細胞因子的作用具有網絡性的特點，人們需明確檢測方法所測定的細胞因子成分，并考慮其抑制劑和可溶性受體的水平，將各種結合使用，有可能得到較為可靠的結果。
測尚未在臨床診斷上廣泛開展，已知目前采用的細胞因子檢測方法均不完善，且不同的檢測方法所得的結果差異較大，給臨床診斷與治療帶來一定的困難。因此，有必要了解各種檢測方法的特性及影響因素。

目前，細胞因子生物學活性檢測和濃度測定方法主要有以下幾類

一.生物學檢測法

生物學檢測又稱生物活性檢測，是根據細胞因子特定的生物活性而設計的檢測法。由于各種細胞因子具有不同的活性，例如IL-2促進淋巴細胞增殖，TNF殺傷腫瘤細胞，CSF刺激造血細胞集落形成，IFN保護細胞免受病毒攻擊，因此選擇某一細胞因子獨特的生物活性，即可對其進行檢測。生物活性檢測法又可分為以下幾類：

1．細胞增殖法

許多細胞因子具有細胞生長因子活性，特別是白細胞介素，如IL-2刺激t細胞生長、IL-3刺激肥大細胞生長、IL-6刺激漿細胞生長等。利用這一特性，現已篩選出一些對特定細胞因子起反應的細胞，并建立了只依賴于某種因子的細胞系，即依賴細胞株（簡稱依賴株）。這些依賴株在通常情況下不能存活，只有在加入特定因子后才能增殖。例如IL-2依賴株ctll-2在不含IL-2的培養基中很快死亡，而加入IL-2后則可右體外長期培養。在一定濃度范圍內，細胞增殖與IL-2量呈正比，因此通過測定細胞增殖情況（如使用3h-tdr摻入法、MTT法等）鑒定IL-2的含量。除依賴株外，還有一些短期培養的細胞，如胸腺細胞、骨髓細胞、促有絲分裂原刺激后的淋巴母細胞等，均可作為靶細胞來測定某種細胞因子活性。

2．靶細胞殺傷法

是根據某些細胞因子（如TNF）能在體外殺傷靶細胞而設計的檢測方法。通常靶細胞多選擇體外長期傳代的腫瘤細胞株，利用同位素釋放法或染料染色等方法判定細胞的殺傷率。

3．細胞因子誘導的產物分析法

某些細胞因子可刺激特定細胞產生生物活性物質，如IL-2、IL-3誘導骨髓細胞合成胺、IL-6誘導肝細胞合成α1-抗糜蛋白酶等。通過測定所誘生的相應產物，可反映細胞因子的活性。