【結果判斷】
細胞出現程序化細胞死亡時,在瓊脂糖凝膠電泳帶上呈現有一定間隔的梯狀條帶,而細胞壞死時則呈模糊的片狀條帶(無間隔),陰性對照者僅在近電泳點樣處出現基因組條帶。
(3)流式細胞儀觀察-PI染色法
【原理及意義】
細胞凋亡時,流式細胞檢測可呈現亞二倍體核型峰的特征。此外,根據細胞光散射特
點,應用碘化丙啶(PI)染色可使之與壞死相區別。在DNA直方圖上,凋亡細胞出現亞二倍體峰,表現為二倍體峰(G1細胞)的減少,在G1峰左側出現亞二倍體細胞群的峰型。而壞死時,細胞周期中的細胞均出現不同程度的減少,亞二倍體細胞量多少不等。在光散射圖譜上,前向光散射與細胞大小有關,細胞凋亡時常表現為細胞皺縮,故前向光散射低于正常。細胞壞死時,常表現為細胞腫脹,故前向光散射高于正常。側向光散射與細胞內粒子性質有關,由于細胞凋亡或壞死均有細胞內碎片增多,故側向光散射均高于正常。總之,細胞凋亡出現低于正常的前向散射和較高的側散射,壞死時則呈較高的前、側散射光譜。
【材料】
1試劑:碘化丙啶(PI)染色液,Rnase(1mg/mL),70%冷乙醇,0.01mol/L、Ph7.2PBS。
2器材:試管,流式細胞儀。
【方法】
(a)標本制備
1培養細胞
(1)收集懸浮細胞于離心管中。貼壁細胞視情用酶消化后制成單細胞懸液,懸浮細胞合并。
(2)800~1000r/min離心,5min,共2次。
(3)用400目篩網過濾2次。
2新鮮實體組織
(1)取材組織用PBS漂洗干凈后,浸泡在含PBS的平皿或青霉素小瓶中。
(2)用眼科剪盡可能將組織剪碎。
(3)吸去上清液,組織塊轉入大瓶中加入10~20mL組織消化酶(含200μg/mL膠原酶),37℃,30min,并在磁力攪拌器上攪拌。
(4)在不銹鋼網上輕輕研磨,使組織和細胞分離。
(5)濾液用200目篩網過濾2次。
(b)熒光染色:上述細胞制備后均應進行熒光染色。
(1)制備的單細胞懸液可用70%乙醇固定,4℃保存。
(2)染色前用PBS進行離心沉淀去除固定液。
(3)加200uL RnaseA,37℃水浴30min。
(4)再加入800uLPI染色液混勻,至4℃避光30min。
(5)上機測試。記錄激發波長488nm處紅色熒光。
【結果】
細胞凋亡時,G1峰左側出現亞二倍體細胞群的峰型。在光散射圖譜上,前向光散射低于正常,側向光散射高于正常。細胞壞死時,細胞周期中的細胞均出現不同程度的減少,亞二倍體細胞量多少不等。在光散射圖譜上,前向光散射和側向光散射均高于正常。
【注意事項】
懸浮細胞收集時要保證足夠數量,否則影響結果準確性。