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    發布時間:2020-09-15 10:43 原文鏈接: 細胞凋亡(apoptosis)的檢測3

    【結果判斷】

    細胞出現程序化細胞死亡時,在瓊脂糖凝膠電泳帶上呈現有一定間隔的梯狀條帶,而細胞壞死時則呈模糊的片狀條帶(無間隔),陰性對照者僅在近電泳點樣處出現基因組條帶。

    (3)流式細胞儀觀察-PI染色法

    【原理及意義】

    細胞凋亡時,流式細胞檢測可呈現亞二倍體核型峰的特征。此外,根據細胞光散射特

    點,應用碘化丙啶(PI)染色可使之與壞死相區別。在DNA直方圖上,凋亡細胞出現亞二倍體峰,表現為二倍體峰(G1細胞)的減少,在G1峰左側出現亞二倍體細胞群的峰型。而壞死時,細胞周期中的細胞均出現不同程度的減少,亞二倍體細胞量多少不等。在光散射圖譜上,前向光散射與細胞大小有關,細胞凋亡時常表現為細胞皺縮,故前向光散射低于正常。細胞壞死時,常表現為細胞腫脹,故前向光散射高于正常。側向光散射與細胞內粒子性質有關,由于細胞凋亡或壞死均有細胞內碎片增多,故側向光散射均高于正常。總之,細胞凋亡出現低于正常的前向散射和較高的側散射,壞死時則呈較高的前、側散射光譜。

    【材料】

    1試劑:碘化丙啶(PI)染色液,Rnase(1mg/mL),70%冷乙醇,0.01mol/L、Ph7.2PBS。

    2器材:試管,流式細胞儀。

    【方法】

    (a)標本制備

    1培養細胞

    (1)收集懸浮細胞于離心管中。貼壁細胞視情用酶消化后制成單細胞懸液,懸浮細胞合并。

    (2)800~1000r/min離心,5min,共2次。

    (3)用400目篩網過濾2次。

    2新鮮實體組織

    (1)取材組織用PBS漂洗干凈后,浸泡在含PBS的平皿或青霉素小瓶中。

    (2)用眼科剪盡可能將組織剪碎。

    (3)吸去上清液,組織塊轉入大瓶中加入10~20mL組織消化酶(含200μg/mL膠原酶),37℃,30min,并在磁力攪拌器上攪拌。

    (4)在不銹鋼網上輕輕研磨,使組織和細胞分離。

    (5)濾液用200目篩網過濾2次。

    (b)熒光染色:上述細胞制備后均應進行熒光染色。

    (1)制備的單細胞懸液可用70%乙醇固定,4℃保存。

    (2)染色前用PBS進行離心沉淀去除固定液。

    (3)加200uL RnaseA,37℃水浴30min。

    (4)再加入800uLPI染色液混勻,至4℃避光30min。

    (5)上機測試。記錄激發波長488nm處紅色熒光。

    【結果】

    細胞凋亡時,G1峰左側出現亞二倍體細胞群的峰型。在光散射圖譜上,前向光散射低于正常,側向光散射高于正常。細胞壞死時,細胞周期中的細胞均出現不同程度的減少,亞二倍體細胞量多少不等。在光散射圖譜上,前向光散射和側向光散射均高于正常。

    【注意事項】

    懸浮細胞收集時要保證足夠數量,否則影響結果準確性。

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