組織和細胞RNA的制備

一、 組織和細胞總RNA提取：
異硫氰酸胍法
（一）試劑準備

1．CSB緩沖液：42mM檸檬酸鈉；0.83% N-lauryl sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸鈉)；0.2 mM β-巰基乙醇。

2．變性液：異硫氰酸胍（終濃度 4 M）25g、CSB緩沖液 33ml，混合直至完全溶解，可在65℃助溶。4℃保存備用。

3．2 M乙酸鈉：pH 4.0。

4．異丙醇

5．無水乙醇、70%乙醇

6．酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）
7．DEPC H₂O：100ml ddH₂O中，加入DEPC 0.1ml，棄分振蕩，37℃孵育過夜。15磅高壓滅茵，4℃保存備用。
（二）操作步驟 
1．樣品處理：
（１）培養細胞：收集細胞1-2×10⁷，離心，500g×5min。對于貼壁培養細胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化后，PBS重懸細胞并轉移至10ml離心管中；懸浮培養細胞可直接轉移離心管；離心：500g×5min；PBS洗滌2次。棄上清，置冰浴。加預冷變性液2 ml，充分搖動，使細胞裂解完全。以下操作均在冰浴中進行。
（２）組織：取1-2g組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置組織勻漿器中，加入預冷的變性液12ml，在冰浴中充分勻漿。
2．加2 M乙酸鈉(pH 4.0)0.2ml，混合后將溶液轉移至5ml離心管中。
3．加酚：氯仿：異戊醇2.2ml，顛倒混合用力振蕩10s，冰上放置10min。
4．4℃離心，12000g×20min。
5．小心吸取上層含有RNA的水相，并轉移至一新的5ml離心管中。避免吸取兩相之間的蛋白物質。
6．加等體積的異丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。
7．4℃離心，12000g×15min。
8．棄上清，再加變性液2ml重懸RNA沉淀物，振蕩直至RNA完全溶解（必要時可65℃水浴促溶）。
9. 加入等體積異丙醇，置-20℃ 30min。
10. 4℃離心，12000g×15min。
11. 棄上清，加入70%乙醇4ml洗滌RNA沉淀。4℃離心，8000g×5min。
12. 棄上清，將沉淀晾干。
13. 加入適量DEPC H₂O溶液解RNA（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事項：
1．所有實驗過程均須避免Rnase的污染。
2．要避免沉淀完全干燥，否則RNA難以溶解。
TRIzol法
TRIzol RNA提取試劑盒是由GIBCO BRL公司推出專供提取RNA的產品，其操作方便、快捷。
（一）試劑準備
1． TRIzol試劑。
2．氯仿
3．異丙醇
4．75%乙醇（DEPC H₂O配制）
5．DEPC H₂O
（二）操作步驟
1． 樣品處理：
（１）培養細胞：收獲細胞1-5×10⁷，移入1.5ml離心管中，加入1ml Trizol，混勻，室溫靜置5min。
（２）組織：取50-100mg組織（新鮮或-70℃及液氮中保存的組織均可）置1.5ml離心管中，加入1ml Trizol充分勻漿，室溫靜置５min。
2．加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。
3．4℃離心，12000g×15min，取上清。
4．加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。
5．4℃離心，12000g×10min，棄上清。
6．加入1ml 75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4℃，7500g×5min，棄上清。
7.  晾干，加入適量的DEPC H₂O溶解（65℃促溶10-15min）。
（三）注意事項
1．   樣品量和Trizol的加入量一定要按步驟（1）的比例，不能隨意增加樣品量或減少Trizol量，否則會使內源性RNase的抑制不完全，導致RNA降解。
2．   實驗過程必須嚴格防止RNsae的污染。
二、總RNA定量
    RNA定量方法與DNA定量相似。RNA在260nm波長處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長分光測定RNA濃度，OD值為1相當于大約40μg/ml的單鏈RNA。如用25px光徑，用 ddH₂O稀釋DNA樣品n倍并以ddH₂O為空白對照，根據此時讀出的OD₂₆₀值即可計算出樣品稀釋前的濃度：
RNA（mg/ml）=40×OD₂₆₀讀數×稀釋倍數(n)/1000
    RNA純品的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值為2.0，故根據OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值可以估計RNA的純度。若比值較低，說明有殘余蛋白質存在；比值太高，則提示RNA有降解。