間接免疫熒光顯微鏡檢術可使兩種或更多種抗原可以在同一切片，同一時間內被顯示出來，可用于（1）細胞標記；（2）免疫熒光篩選干細胞。
| 實驗方法原理 | 通過使用激發波長及發射波長均不相間的熒光染料而進行的。通常限用兩種熒光染料，最常見的是羅丹明（綠光激發，發射紅光）和熒光素（藍光激發、發綠光）聯合使用。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1. 當進行雙標記實驗時，最重要的準則是：第一抗體應為不同類型，從而使第二抗體能分別識別之。第一抗體最好是來源于不同免疫動物。但如使用單克隆抗體，這一要求就有可能達不到，當使用單抗時，不同型的抗體如IgG和IgM，可被第二抗體確切區分。但不同亞類（IgG 1和IgG 2）的抗體通常不能被二抗確切區分。
3. 在試圖進行雙標記實驗之前，應進行單標記實驗，摸出不同的第一抗體和第二抗體的最佳稀釋度。 |
| 注意事項 | 1. 當進行雙標記實驗時，最重要的準則是：第一抗體應為不同類型，從而使第二抗體能分別識別之。第一抗體最好是來源于不同免疫動物。但如使用單克隆抗體，這一要求就有可能達不到，當使用單抗時，不同型的抗體如IgG和IgM，可被第二抗體確切區分。但不同亞類（IgG 1和IgG 2）的抗體通常不能被二抗確切區分。 2. 在試圖進行雙標記實驗之前，應進行單標記實驗，摸出不同的第一抗體和第二抗體的最佳稀釋度。 3. 在進行雙重染色之前，必須對所選擇的一抗分別進行單獨染色預實驗，預實驗條件必須與雙染條件相同，在觀察預實驗結果和抗體定位正確后，再進行雙染實驗。 |
| 其他 | 組織切片做免疫熒光時，背景色重時的兩種情況： 一、組織切片因染色過程或組織非特異熒光而出現的背景色； 二、拍照時因硬件設施或取景器設置而出現的背景色。 針對第一種問題有以下幾點建議：1. 采用高品質的多聚甲醛固定減少普通甲醛的自發螢光 2. 切片厚度減薄 3. 切片貼片后流水沖洗干凈減少雜質熒光 4. 一抗以及二抗漂洗干凈（非常重要） 5. 選用高品質封片介質。 針對第二種問題有以下幾點建議：1. 曝光時間的控制 2. 暗室操作。 |