納觀生物超高分辨率顯微成像原理

，黑色箭頭表示的物體 AB 經過物鏡等之后在相機上成像。由于光的衍射，物體上的點如 A、B，在相機上并不是單獨的點，而是一個個有一定大小的斑，被稱為夫瑯禾費衍射斑，如右側的同心圓所示。根據光學中的瑞利判據，1873 年，德國物理學家恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）推算出，顯微鏡能分辨的物體上兩點 A、B 的最小距離 h 為：

h = 0.61λ/(n*sinθ)

       這個公式就是光學顯微鏡的分辨率公式，或稱為光學衍射極限。其中，λ為光的波長，n為物方的折射率，θ為物體與物鏡邊緣連線和光軸的夾角。(n*sinθ)也常稱為數值孔徑，簡寫為 NA。目前常用的高倍物鏡（100x）NA值為 1.49，所以對于可見光，比如波長 500 納米的綠光，計算得到顯微鏡的分辨率約為 200 納米。因此可知，即使再提高物鏡的放大倍率，也不能提高顯微鏡的分辨率。而 200 納米這個數值也就通常被人稱作衍射極限。如上圖中（a）（b）（c）所示，當兩個點逐漸靠近到一個程度時，我們就很難分辨該光斑是一個點還是兩個點疊加在一起了（如圖（c）），更別提其空間/立體位置關系了。