納米孔測序搞定超級難搞的基因

　　Brenton Graveley是在2014年4月收到他的第一臺MinION測序儀的。他所在的康涅狄格大學實驗室是首批獲得Oxford Nanopore Technologies測序儀的客戶。盡管準確性不穩定，通量也不高，但Graveley和他的同事決定立刻就試試。

　　對于MinION，眾多討論都集中在它的迷你尺寸：早期的試用者將它帶到疫情爆發區和熱帶雨林。不過對于 Graveley來說，MinION讀取的DNA鏈長度與測序儀本身一樣讓人激動。大多數測序儀依賴化學反應，隨著時間的推移容易出錯，這意味著只能讀取 短片段的DNA。MinION則是在DNA分子穿過狹窄的納米孔時觀察它們，只要DNA穿過，它們就產生數據。

　　在一篇發表在《Genome Biology》的文章中，Graveley和兩個實驗室成員，Mohan Bolisetty和Gopinath Rajadinakaran，證明了這些讀長如何幫助他們解釋Dscam1的行為。這是個很難對付的基因，在形成昆蟲大腦的結構時起了關鍵作用。這個基因可產生數千個略微不同的蛋白質，很難用常規的測序技術去了解。

　　絕望的轉錄組

　　Graveley的實驗室研究了轉錄組。他們特別感興趣的是那些RNA分子可以采取不同的形狀，或異構體， 這是隨機的，或取決于細胞在特定時間需要什么。通過選擇性剪接的過程，不同的亞基組成了基因。許多基因有兩個或更多的互斥外顯子，而那些表達為RNA和蛋 白質的外顯子對細胞行為有著重大影響。

　　作為果蠅中選擇性剪接的世界紀錄保持者，Dscam1帶來了非凡的挑戰。Dscam1由115個外顯子組成，其中只有20個總是轉錄成RNA。另外95個存在于四個相互排斥的外顯子簇中，因此，人們預測Dscam1可能有超過3.8萬個異構體。

　　“到目前為止，這個數量級超過了其他任何一個基因，”Graveley解釋道。這種靈活性也許有助于了解 Dscam1的功能。它產生的蛋白質幫助識別昆蟲大腦中的單個神經元，讓它們不同于它們的鄰居。在一些實驗中，Dscam1經過改造以產生較少的RNA異 構體，結果使果蠅發育過程中的神經連接遭到破壞，嚴重時甚至造成死亡。

　　Dscam1也在昆蟲的免疫系統中發揮作用，這是它產生眾多異構體的另一原因。在對付某些病原體時，每個分 子都或多或少有效。然而，要弄清楚特定樣品中存在哪些異構體，這不是一般的難。Graveley已經研究了十多年，但還是無法回答一些基本的問題：一些異 構體是不是更常見、更重要？理論上的異構體全都表達嗎？

　　讀長的困擾

　　即使是那些先進的測序技術，它們一次也只能讀取幾百個DNA堿基。然而，許多基因的選擇性剪接發生在mRNA前體分子的多個位置，它們可能相距幾千個堿基，大大超過了這些測序平臺的讀長。目前還沒有辦法填補這些缺口。

　　Graveley嘗試了很多方案。他甚至用了過時的Sanger測序方法，雖然很慢，也很費力，但能跨越更長的讀取。實驗室也嘗試用Illumina測序儀來重建RNA轉錄本。“這確實有用，”Graveley說，“不過許多文庫制備的假象使其更加復雜。”

　　Graveley的首選方法是使用Pacific Biosciences的測序儀。它像MinION一樣，是基于長讀取的單分子技術。PacBio測序比納米孔更加成熟，結果也相當可靠。此外，它有著高的通量。對于研究選擇性剪接的研究人員來說，這無疑是理想中的技術。不幸的是，它太貴了。因此，Graveley的團隊想看看，MinION是否能作為一個替代選擇。

　　在這篇文章中，他們聚焦了Dscam1 RNA上一段1.8 kb的區域，它覆蓋95個選擇性剪接外顯子中的93個。為了獲得樣品，他們搗爛了果蠅的頭部，從中分離出Dscam1 RNA，并逆轉錄成cDNA進行測序。他們還測序了其他三個選擇性剪接的基因，Rdl、MRP和Mhc。

　　選擇性剪接

　　Graveley對MinION的最大擔心是它那不穩定的準確性。盡管大多數測序儀都能輕松達到99% 以上的準確性，但他的小組在MinION平臺上只達到90%。這其實已經比大多數用戶要好了。因此，用戶必須考慮到這一點：這個設備在重測序項目中相當可 靠，但對于de novo測序，它還有待觀察。

　　為了確定確切的轉錄異構體，MinION并不需要完美讀取每個RNA分子，它只要將外顯子區分開就行了。對于Dscam1，這些外顯子可能有80%是相同的。事實上，Graveley及其同事發現，MinION確實能做到這一點。

　　在大約33,000個高質量的Dscam1讀取中，幾乎29,000個完美匹配。為了進一步檢查其準確性， 研究人員在Illumina平臺上測序了同一個樣品。盡管Illumina測序不能給出完整的異構體，但它顯示出相同比例的外顯子，說明MinION能給 出一幅完整且無偏向的圖畫。

　　“結果表明，選擇性剪接或許是這個平臺的理想應用之一，”Graveley談道。“即使是一個這么復雜的基因，我們也能準確區分異構體。除非你的外顯子非常非常小，或者兩個外顯子幾乎完全相同，否則這種準確性都是足夠的。”