目前臨床實驗室中應用的糖化血紅蛋白檢測方法主要有兩大類: 一類方法基于糖化血紅蛋白與非糖化血紅蛋白所帶的電荷不同, 如離子層析法、電泳等方法; 另一類方法基于血紅蛋白上糖化基團的結構特點, 如親和層析、離子捕獲法和免疫法等。其中高效液相離子層析法(HPLC )被公認為金標法。
1. 離子層析法 離子層析法精密度高、重復性好且操作簡單, 被臨床廣泛采用。檢測原理由于血紅蛋白β 鏈N 末端纈氨酸糖化后所帶電荷不同, 在偏酸溶液中總糖化血紅蛋白( GH b) 及H bA 均具有陽離子的特性, 因此經過陽離子交換層析柱時可被偏酸的緩沖液平衡過的樹脂來吸附, 但二者吸附率不同, GH b正電荷較少吸附率較低, HbA 正電荷較多吸附率較高。用不同pH 的磷酸鹽緩沖液可以分次洗脫出GH b 和H bA, 用KCN 可將H b轉化為高鐵氰化血紅蛋白, 用分光光度計測定。或者得到相應的H b層析譜, 其橫坐標是時間, 縱坐標是百分比。HbA1c值以百分率來表示。現在大部分都用全自動測定儀測定,如日本TOSOH 公司生產的全自動糖化血紅蛋白分析儀曾應用于美國糖尿病控制和并發證試驗( DCCT) 研究, 其離子交換H PLC法是H bA1c檢測的金標準。當前推出的HLC- 723G7從開機到報告第一個結果僅需3. 6 m in, 標本無需前處理, 操作維護都非常方便, 是目前測試GH b精密度、準確性最高的方法。國內主要采用Bio- Rex70陽離子樹脂微柱層析法, 其微柱可重復使用多次,更大型的儀器有SCIENTIFIC公司的Hb- Gold, 除可全自動測定糖化血紅蛋白外, 還可分離檢測血紅蛋白的600多種變異體和亞型, 用于地中海貧血等疾病的診斷。但其缺點是價格昂貴, 僅在一些發達國家使用, 且容易受到如下干擾: 胎兒血紅蛋白(H B -F)與HbA1 c的帶電性很相近, 在離子交換HPLC分析圖上可能呈現一個獨立的H b- F 峰, 也可能與H bA1c 峰重疊( 視離子交換柱的分辨能力而定)。
2. 手工微柱法 手式微柱操作會受到人工因素影響, 可能會洗脫不完全或過度洗脫并受外界環境溫度的影響, 而某些血紅蛋白如H bF異常增加時, 也會與糖化血紅蛋白同時洗脫, 從而使結果產生偏差。目前有Bio- Rad和西班牙B IOSYSTEM S等多家公司產品, 相應的儀器以英國DREW SCIENTIFIC公司DS 5糖化血紅蛋白儀為例( B io- Rad公司IASTA 亦為同一產品), 采用微柱法離子交換層析和梯度洗脫技術可全自動分離血紅蛋白的變異體與亞型, 除可測定糖化血紅蛋白外, 還可同時檢測出血紅蛋白S( H bS)與血紅蛋白C( H bC )的存在與否, 在計算糖化血紅蛋白值時會自動扣除變異體產生的影響, 從而使結果更為準確, 可靠, 變異系數( CV ) 值< 2%。同時該儀器配有專門的稀釋溶血器, 可直接進行全血操作, 5 m in即可報告結果, 并自動儲存樣品檢測結果, 層析柱價格也較為低廉, 適合于較多標本的醫院檢測,但由于手工操作層析時間和微柱的質量不易控制, 易產生操作技術誤差, 重復性欠佳。
3. 瓊脂凝膠電泳法 H b及H bA1帶正電荷, 電泳時向負極移動。因為H bA 的β 鏈N - 末端所帶電荷被糖基消除, 帶電量少于H bA, 等電點低, 泳動速度慢, 所以H bA1 即GH b本身帶紅色, 所以可直接比色或掃描。用H bA1 占H b的量來表示。毛細管電泳也能分離檢測糖化血紅蛋白和血紅蛋白的變異體。普通電泳法對H bA 和H bA1 分離效果不理想, 目前尚無商品化且具有批量樣本通過能力的儀器面世, 相當程度地限制了該方法的臨床應用。
4. 等電點聚集法 也是測定GH b的新技術, 它是在聚丙烯酞凝膠中加人載體兩性介質( 如am pho lin) 的薄板上形成一個由陽極到陰極逐漸增加的pH 梯度, 溶血液中各個組份將移動到各自的等電點的pH 位置上, 這樣就得到比一般電泳法更好的分劃效果和比較集中的色帶, 通過分辨率高的微量光密度儀掃描, 可以準確地測定出各自組份的含量。由于它能夠分辨出一級結構不同的H bA、H bA c、H bF、H bS 及H bC等, 可完全避開各種物質的干擾, 是一種理想的方法, 但儀器價格相當昂貴, 難于用作常規檢測。
5. 親和層析 利用生物高分子能與相應的專一配基分子可逆結合的原理, 將配基通過共價鍵牢固地結合于固相載體上制得親和吸附系統, 帶有雜質的高分子分離目的物在一定條件下,能以某種次級鍵與已同相化的配基結合, 而雜質則不吸附, 除去雜質后變換條件, 又可以使待分離的高分子物質重新解離, 獲得純化。GHb的親和色譜載體是氨基苯硼酸瓊脂糖凝膠, 當總的GHb通過載體時, 穩定型GH b分子表面含葡萄糖的順式二糖醇部分與載體固定相上的硼酸基因呈配位特異結合, 其它非糖化Hb及不穩定型GHb, H bF等, 隨流動相(天門冬酞胺緩沖液)流出, 然后用另一種含糖或多經化合物流動相(山梨糖醇緩沖液)將GH b洗脫下來, 利用兩部分H b本身的顏色, 在415 nm 條件下測定并計算出親和色譜所測的GH b。
英國DREW SC IENT IFIC 公司的DST 糖化血紅蛋白分析儀是一種快速床邊糖化血紅蛋白儀。它采用硼酸親和層析法, 只需10 ul全血即可在4 m in 內快速分離檢測糖化血紅蛋白, 為臨床提供即時的化驗結果, 從而使醫生在患者就診的第一時間明確診斷并制定相應的治療方案, 特別適合于臨床科室使用, 尤其對于小兒患者而言更有優勢。其檢測結果也完全達到并超過臨床要求, CV值在5%以內。
優點: 操作簡單、快速、價廉, 特異性強, 不受異常血紅蛋白的干擾, 對經翻譯以后修飾的血紅蛋白和病理血紅蛋白的影響相對不敏感, 對血標本儲存的時間也不象離子交換法那樣嚴格。缺點: 檢測結果為糖化血紅蛋白總量, 不能測試GH b的單一組份,且包含H bA1的糖化組份, 因此將親和色譜所測出的GH b 稱為總的GHb是不確切的, 嚴格來說是占不同百分數的各種GH b, 目前對其測定內容的命名國內外尚不統一, 目前日本化學工業株式會社所生產試劑盒稱為糖化一親和色譜GHb, 以便與其他方法所測H bA, 或H bAc相區別。但并不影響它作為可靠的糖代謝指標的價值。大量實驗還證明, 該法所測GH b 值與H PLC 等法所測H bA, H bA c及空腹、餐后2 h血糖均呈高度相關, 表明該法對糖尿病患者是一種較理想的病情監測指標。
6. 離子捕獲法 近發展起來的新方法, 代表儀器有Abbo tt的IMX, 其原理是糖化血紅蛋白與相應抗體結合后, 聯以熒光標記物, 形成一反應復合物, 再聯結帶負電荷的多聚陰離子復合物, 而在IMX 反應孔中的玻璃纖維預先包被了高分子的四胺合物, 使纖維表面帶正電, 使前述的反應復合物吸附在纖維表面, 經過一系列清洗后測定其熒光強度, 從而得到糖化血紅蛋白的濃度, 該方法適用于成批糖化血紅蛋自標本的檢測。
7. 免疫凝集法 糖化血紅蛋白與相應的單抗結合進而發生凝集反應, 通過測定吸光度來表示凝集量, 可用于全自動生化分析儀上進行測定。以免疫分析為基礎的儀器( DCA2000) 在最近幾年中得到推廣, 約在7 m in 內就能讀取數據, 要求對樣品成批試驗, 每次試驗均應使用一個新試劑盒, 操作前應注意混勻試劑。免疫比濁法重復性較好, 但易受脂肪血、黃疸等樣本因素影響, 抗交叉污染較差, 而且要求血紅蛋白在一定范圍之間才能達到較好的線性。
8. 金標免疫滲濾法(金標法) 免疫滲濾法, 操作較簡便, 目前代表儀器有挪威NycoCardReaderII特種蛋白多功能全定量金標檢測儀。
9. 化學發光法 采用離子捕捉免疫分析法, 應用抗原抗體反應原理, 聯以熒光標記物, 通過連接帶負電的多陰離子復合物, 吸附到帶正電的纖維表面, 經過一系列徹底清洗等步驟后, 測定熒光強度變化率, 計算濃度。采用專用試劑包和免疫發光分析儀,其檢測系統易于規范和重復, 可減少操作技術誤差, 檢測的靈敏度和特異性高, 批內、批間變異系數小, 回收率高, 準確度高, 交叉污染率小, 影響因素少。
10. 放射免疫法 優點: 精密度高、特異性強、快速、價格相對便宜, 可批量測試, 且不受各種干擾因素的影響。缺點: 目前對制備高效價的抗體尚存在許多困難, 仍處于研究中, 未能形成商品化試劑盒。
11. 酶法 原理為用特殊蛋白酶分解Hb, 3~ 5 m in內果糖基氨基酸從H b分離, 果糖基氨基酸氧化酶( FAOD )從果糖基氨基酸產生H2O2, H 2O2經POD與DA- 64反應, 選擇751 nm 測吸光度改變求得GH b濃度。