利用物體不同結構成分之間的折射率和厚度的差別，把通過物體不同部分的 光程差轉變為振幅（ 光強度）的差別，經過帶有環狀光闌的聚光鏡和帶有相位片的相差物鏡實現觀測的顯微鏡。主要用于觀察活細胞或不染色的組織切片，有時也可用于觀察缺少反差的染色樣品。
把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結構間的對比度，使各種結構變得清晰可見。光線透過標本后發生折射，偏離了原來的光路，同時被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變為1/2λ，兩束光合軸后干涉加強，振幅增大或減下，提高反差。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通 光學顯微鏡4個特殊之處：
1.環形光闌（annular diaphragm） 位于光源與聚光器之間，作用是使透過聚光器的光線形成空心 光錐，焦聚到標本上。
2.相位板（annular phaseplate）在 物鏡中加了涂有 氟化鎂的相位板，可將 直射光或衍射 光的相位推遲1/4λ。分為兩種：
（1）A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波 合軸后光波相加，振幅加大，標本結構比周圍介質更加變亮，形成亮反差（或稱負反差）。
（2）B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸后光波相減， 振幅變小，形成暗 反差（或稱正反差），結構比周圍介質更加變暗。
3.合軸調節望遠鏡：用于調節環狀光闌的像與相板共軛面完全吻合。