等電聚焦凝膠電泳是依據蛋白質分子的靜電荷或等電點進行分離的技術，等電聚焦中，蛋白質分子在含有載體兩性電解質形成的一個連續而穩定的線性pH梯度中電泳。載體兩性電解質是脂肪族多氨基多羧酸，在電場中形成正極為酸性，負極為堿性的連續的pH梯度。蛋白質分子在偏離其等電點的pH條件下帶有電荷，因此可以在電場中移動；當蛋白質遷移至其等電點位置時，其靜電荷數為零，在電場中不再移動，據此將蛋白質分離。
等電聚焦中，只有在凝膠兩端給以高電壓時，才能獲得較好的蛋白質條帶分辨率，這就需要非常有效的凝膠冷卻系統（否則會導致燒膠），即凝膠同期周圍液體之間的熱傳遞效率要高。由于平板膠熱傳遞能力高，并可方便的同時比較多種蛋白質樣品，所以平板膠用在等電聚焦上的居多。
由于等電聚焦對蛋白質的電荷差異非常敏感，若要好的重復性，制備蛋白樣品時一定要小心，要避免任何對蛋白質化學組成和結構的修飾。另外，蛋白質－脂類、蛋白質－蛋白質相互作用可引起電荷改變，進而導致等電點遷移或紋理現象。除非特殊需要研究蛋白質－蛋白質相互作用或者必須保持蛋白質的生物學功能，等電聚焦通常在含有尿素的變性凝膠系統中進行。使用非離子去垢劑也可以提高分辨率。
等電聚焦的缺點電聚焦要求用無鹽溶液，而在無鹽溶液中蛋白質可能發生沉淀；樣品中的成分必需停留于其等電點，不適用在等電點不溶或發生變性的蛋白質。