timsTOF fleX質譜儀
diaPASEF：進一步提高30%離子利用率
Rohan表示：timsTOF fleX 是全球第一臺將組織樣本分析與體液樣本分析相結合的質譜儀。它的優點顯而易見：許多中心實驗室現在不僅可以測定組織樣本，還可以做蛋白質組學，而他們不必再購買兩種儀器。同時發布的另一重要產品是diaPASEF（非數據依賴采集的PASEF）。過去人們用dda（數據依賴采集）來做4D組學研究，現在增加了4D diaPASEF。利用PASEF固有的高離子利用率優勢，新的diaPASEF工作流程通常可進一步提高30％離子利用率。
diaPASEF 采集方法。a. timsTOF Pro 質譜儀的離子光學示意圖。b. HeLa細胞胰蛋白酶解裂解液中多肽離子淌度和m/z的關系 c. diaPASEF，四極桿分離窗口（灰）作為離子淌度（箭頭）的函數是動態定位的。在單個TIMS掃描中，選擇各質量范圍的離子碎裂，記錄所有母離子離子淌度解析的MS2譜圖。d. 用分段的四極桿分離法實施diaPASEF母離子選擇 e. 用圖d的母離子選擇法獲得的一個diaPASEF掃描樣例
不同數據采集方法的效率。a. Y6 碎片離子的提取離子流色譜圖，由BSA酶解的雙電荷DLGEEHFK母離子產生，對比DDA PASEF、DIA和100% 周期利用的diaPASEF方法；b. 合計的提取離子流色譜圖，由一次實驗中Hela酶解的多電荷母離子產生，對比DDA PASEF、DIA和25% 周期利用的diaPASEF方法
Lucy Woods博士補充說：布魯克和馬普研究所diaPASEF的開發者們合作，用4D組學方法研究蛋白質組學和脂質組學，工作發表在biorxiv上。研究組使用超高靈敏度的方法來測定血漿等其它流體樣本；建立了一個由1000多個脂質組成的碰撞截面積（CCS）數據庫，人們現在可在工作流中使用此CCS數據庫。“我認為該成果具有很大應用潛力，它可在脂質學工作流程上繼續擴展，使得人們易于獲取。”
空間定位組學：一臺儀器連接疾病和組學
timsTOF fleX在timsTOF Pro基礎上增加了MALDI功能，Rohan表示：對體液、細胞、組織的脂質組，timsTOF fleX都可以使用MALDI進行脂質分析，用timsTOF fleX一臺儀器連接所有內容。
Michael博士是空間定位組學（SpatialOMx）的主要推動和發明者之一。他補充說：今年我們推出了一個進化的產品，用布魯克創新的timsTOF Pro，結合最先進的MALDI成像技術，使研究者可以開展深度定性的蛋白質組學研究。timsTOF Pro 同時具有4D 蛋白質組學工作流程和 MALDI 成像能力。MALDI 成像將帶來什么？以前在組學和疾病間總有一道鴻溝：有些研究者做高質量的蛋白質組學和脂質組學，特別是當他們使用timsTOF Pro時。他們希望和那些疾病、癌癥患者的醫生交談。但這是一個艱難的對話，因為醫生讀的是組織（切片）。如果你是一個習慣于整天看組織切片的人；你旁邊需要有人研磨組織，然后運行LC-MS。其中總有一個斷點：雖然組學獲得了豐富的化學信息，但卻不是在組織病理的背景下，這就是問題所在。而timsTOF fleX是一臺理想的儀器，它構建了一個生態系統，把組學和疾病兩個領域結合在一起。現在研究者可以真正高效地對話，可在一個平臺上獲得這些結果。
布魯克還推出許多工具來增強這些工作流的能力。比如，使用IntelliSlides (樣本智能載玻片) ，非 MALDI 成像專家的實驗者也可執行該工作流，消除所有的擔憂，將需要啟動試驗的樣本制備時間幾乎降為零。在內部軟件包（MetaboScape）中還內置了許多技能，當研究者開展4D組學實驗、成像實驗時，軟件可以自動把這些信息鏈接在一起，得到關于疾病和疾病狀態的上下文關聯信息。
IntelliSlides?樣本智能載玻片
在空間定位組學（SpatialOMx）中，研究者們將4D組學的深度定性和鑒定與組織形態學相結合。對于空間定位組學的一個重要發明是可使用MALDI引導的SpatialOMx方法，能夠在空間上對指定的組織區域進行分析，從而允許隨后的4D蛋白質組學選擇性地對細胞類型的亞群進行靶向分析。當你觀察疾病狀態時，大部分的區域是組織微結構，所以面對一大塊組織，你想要移除它的一小部分。但問題來了，到底在哪里挑選那一小塊組織？雖然可以用病理學方法，但病理學方法的問題是：對疾病組織內部的檢測不夠靈敏。它只對一種蛋白質敏感，而一種蛋白質可能無法準確描述疾病狀態，難以挑選合適的細胞來進行提取。而當你挑選提取了細胞，你還需把它們送入LC-MS運行。MALDI成像的強大之處在于：它可以無標記地對組織成像，顯示所有的脂質代謝，在組織中的多肽、聚糖的分布。從這些信息中，你可以做出一個非常明智的決定：在哪里提取這些細胞，然后在LC-MS/MS上運行它們，從而獲得對真正需要關注的細胞的深度識別。
timsTOF fleX有兩種空間分辨率模式，標準為20um，放大模式可達到10um。它的另一個優點是：由于采集平方像素，可以記錄真實的形狀，即具有真正的高像素保真度。
當筆者追問是否有其它競爭者時，Rohan毫不猶疑地表示：“空間定位組學方面，我們沒有任何其它競爭者，布魯克正在引領該市場的發展。有些公司質譜前端采用光學顯微鏡觀察組織，但幾乎毫無用處。試想在一個沒有光線黑暗的房間里，用光學技術你將無法區分任何物體。而MALDI成像采用激光的數字化成像，它自己點亮了房間里的燈，對病理切片直接成像。timsTOF fleX的軟件還可以將MALDI成像處理成光學成像、病理學成像人們習慣的觀察形式，完全覆蓋了所有的分子學信息。”
布魯克是第一家從組織中提取細胞，再進行深層次蛋白質組學、代謝組學、脂質組學的公司，在此領域沒有競爭者。如果你觀察一個病理組織切片，但癌細胞擴散了，到底在哪里？用SpatialOMx就可以知道。
用戶合作的成果
timsTOF fleX 幾個試用的客戶分別來自德國、英國和澳大利亞。Michael表示：由于布魯克是 MALDI 成像領域的領導者，該領域有許多頂級參考用戶。10多組關鍵先鋒客戶已來到不萊梅工廠，他們的反饋都非常積極；其中有一些客戶已深深愛上了timsTOF fleX。
Rohan還舉了一個例子，timsTOF fleX的第一個客戶是一個從未做過成像但想做成像的專家，這次他在ASMS上做了演講。因此，timsTOF fleX可以適用于那些想要做成像而從未做過的人。這次同時推出的IntelliSlides?樣本智能載玻片，專門用于timsTOF fleX工作流程的自動化。借助專業軟件，IntelliSlides現在可以讓每個人都能輕松完成MALDI成像。Michael補充說：我們了解到有很多蛋白質組學實驗室想做MALDI成像。但是購買一臺用于成像的專用儀器，他們可能會覺得不值得，比如太難，學習很長時間才能開始成像實驗。而timsTOF fleX無疑是一臺面向實用的儀器，它讓每個實驗室都可以方便地開展質譜成像和組學研究。
在timsTOF fleX上獲得的大鼠腦脂質圖像。20μm空間分辨率，采集5小時，包含312,095張譜圖。右面板顯示從 SCiLS Lab軟件數據集中產生的分段分析。譜圖被聚簇到對應于不同大腦區域的區
就ASMS期間布魯克開展的活動，Michael說：“昨天看到timsTOF fleX展示的數據表現令人印象深刻。我們的兩個客戶在他們的實驗室安裝了timsTOF fleX展示了結果，尤為引人關注，人們都在熱烈討論。今天早上的早餐會更是爆滿。我們以前從未見過這樣的參與熱情，我想這是對timsTOF fleX取得壓倒性成功的一個證明。”
質譜在個體化醫療中的作用
在問到對精準醫學的看法時，Rohan表示：更準確的說法應該是個體化醫療。精準醫學是一個很模糊的詞，很多人談論它卻不理解它。未來將是個體化醫療的時代，精準醫學并沒有什么真正的產出，而布魯克希望通過發展技術來幫助實現個體化醫療。
Michael補充說：對于個體化醫療來說，現在人們最感興趣的是諸如癌癥治療的免疫療法。免疫治療依賴于某些突變，在二代測序方面已做了大量工作；但這些技術不能闡明后基因組的表達情況，而后基因組表達包含很多關于疾病狀態的信息。這是人們真正感受到的鴻溝，現在幾乎無法逾越。你可以采取比如表觀遺傳學的表達來分析。對于表觀遺傳學的表達，可以看到翻譯后修飾蛋白，這是表觀遺傳修飾的最顯著原因之一。這些修飾能反映到脂質代謝水平，比如糖在體內的代謝。timsTOF fleX能看到所有的這一切，不僅看到組學的結果，也能看到組織形態的結果。當你運行timsTOF fleX，就像用免疫法一樣，你可以了解組織中感興趣的蛋白在哪里，蛋白是活性的還是非活性的，如果是活性的它處于什么狀態；還可以通過觀察代謝組學來精確定量，在組學基礎和組織學基礎上，可以看到蛋白質活動的信息。
談到個體化醫學，不免提到布魯克已經通過醫療器械證的MALDI Biotyper，它可以做特定的測試（比如微生物）。但目前癌癥還不能做特定的測試，還需要發現和測定那些生物標志物，timsTOF fleX目前還僅用于醫學研究，但它速度很快，當驗證了這些標志物，當這些測試變成常規測試，并最后通過了驗證時，也許它能成為類似于MALDI Biotyper那樣可用于臨床診斷的儀器。
Michael還談到組織成像和血漿臨床病理學的對比：這是正發生在全球各地的一種思想變化。血漿臨床病理學已經應用了60-100年。比如人們看病時會檢查血液，看不同的化學標志物是否在正常的范圍內。美國的“癌癥登月計劃”的藍絲帶小組建議計劃的第二要務是創建組織分析、3D和4D組織分析。因為現在疾病診斷只是給出在某個時間點上的快照，但人們需要了解疾病如何進展如何反應。這就需要組織分析，特別是像腫瘤在形成到轉移有很多階段，跟蹤這些階段的血液和血漿幾乎是不可能的，因為一直得到相同的信息。但如果獲得3D和4D的組織分析圖，就不僅可以看到腫瘤的變化，還可看到它與周圍細胞通信的方式。這是人類攻克癌癥的未來。timsTOF fleX創立了一種新工具，將重新定義我們從組織角度思考疾病的方式。
各種質譜技術的前景
筆者請兩位比較下列各種技術和未來的前景：（1）MALDI 和 LC-MS；（2）無分離的直接電離技術；（3）質譜成像技術。Michael表示：布魯克在上述領域都在引領市場。timsTOF的推出催化了布魯克在市場上的表現。在科學界，MALDI和電噴霧有不同的研究者群體，但這是有問題的。因為兩者有各自的優勢，若將兩種方法的信息結合起來，一定會得到更多的信息。布魯克是唯一一家致力于將這兩者結合起來的公司，不僅僅是把兩者結合在一個平臺上，還正在開發軟件解決方案和其它的所有支持，這樣才能充分利用LC-MS和MALDI的結合優勢。
而對于無色譜分離質譜分析技術，scimaX已經給出了最好的答案，它真正能夠進行無分離的直接進樣分析。目前在中國，研究者們正在運行磁共振成像質譜（MRMS）的平臺。比如一些團隊正在分析原油非常復雜的混合物，在非常復雜的基質中包含大量的生物分子和小分子。布魯克已經用無分離的直接電離技術開展了一段時間，目前市場上也有一些關鍵的客戶正在引領和推動該技術的進展。Michael表示：人們已經用這臺儀器解決了許多領域獨特的問題。scimaX一個最顯著的特點是：它能夠維持非共價鍵復合物的離子傳輸，并在后端具有超高分辨率的檢測。這兩個關鍵優勢的結合非常適合藥物發現。最近，我們在中科院上海藥物所舉辦了“the State of the Art in Native Mass Spectrometry”研討會。來自世界各地的專家來到這個研討會，討論了scimaX的優點，片段為基礎的藥物發現（Fragment-based Drug Discovery）。實驗表明，scimaX保持了非常弱的非共價相互作用，可以根據感興趣的治療途徑，篩選數千個目標物。
對于質譜成像，布魯克就更加自豪，因為它是第一批推出質譜成像產品的公司，從事質譜成像已有十多年。這首先和布魯克的MALDI創新史密不可分，MALDI創新的一部分就是針對MALDI成像。在 MALDI 和 MALDI 成像方面的歷史使布魯克成為市場領導者。目前世界上所有正在做 MALDI 成像的關鍵參考領導者都是布魯克的用戶。而作為MALDI成像的領導者，布魯克正在推動將MALDI成像運用到各種領域，比如支持臨床研究。
比較和另一種技術DESI的區別，Michael表示：DESI最嚴重的問題是重現性很差，這是技術的固有缺陷。雖然DESI可能成為科學家的“玩具”，但若想每天得到相同的圖像，用DESI是不可能的。“我們有一位用戶最早是DESI的擁躉，甚至被列為DESI的市場參考領導者。但他后來停止使用DESI又選擇了我們的MALDI成像，因為研究生們在不停地抱怨要花好幾個小時來調諧，無法得到有效的結果。停用DESI的另一個原因是無法得到重現的結果來開展臨床研究。他后來飛到我們的一個用戶那里用rapifleX做質譜成像，真切地體會到MALDI成像的穩定和重現性，從而改變了想法，開始用布魯克的MALDI成像。”
Rohan補充道：當你需要將成像應用于臨床，重現性變得非常重要。你希望在系統中放置切片，按下按鈕，得到結果。DESI都是手動調節，結果無法重現；而MALDI成像才能真正實現科學家們將研究用于臨床的夢想。新加坡有位醫生，他每天都做肝臟手術。在對癌癥患者施行手術后，一個很大的問題是腫瘤有可能還在體內，得再為病人做第二次手術，這對病人是極其危險的，而用MALDI成像檢查可以快速地判斷，大幅降低病患的風險。
談到對質譜發展趨勢的看法，Rohan表示：布魯克是第一家開展單細胞工作的公司，比如伊利諾斯州厄巴納香檳 (UIUC)的Sweedler研究組正在使用布魯克質譜進行單細胞研究。無論是MALDI還是ESI源的質譜，未來技術發展最重要的驅動力就是靈敏度。因為研究蛋白質不能像測序或基因組學那樣使用基因擴增技術。所以，未來質譜技術進步的最大挑戰和驅動力就是靈敏度的提升。布魯克未來重要的三大發展方向是：組學、制藥尤其是生物制藥、成像技術。這三大領域也是本屆ASMS布魯克的重點。
中國科學界采納新技術的速度正在加快
比較中國和歐美的市場及需求，Rohan認為他們是基本相同的，在過去的5-10年已經有了很大的改變。就目前而言，創新常發生在美國和歐洲，而很多優秀的科學家回到中國，會越來越早地使用新技術，比如，廈門大學細胞應激生物學國家重點實驗室和北京大學醫學部精準醫療多組學研究中心是布魯克在中國最早的timsTOF Pro的用戶，清華大學化學系是最早的timsTOF用戶之一。
談到中國客戶的特點，Rohan表示：“中國是全球第二大的蛋白質組學市場，在質譜成像方面稍稍落后，我們正在努力改變這種狀況。中國的科學家和全球的科學家也是一樣的，科學研究的首要任務都是為本國造福；唯一的問題是如何讓更多的中國科學家在世界上更早地體驗和使用新技術。相對來說，在中國購買一套科學儀器設備周期比較長，這可能是導致中國科學家體驗新技術比較晚的原因。從科學研究的水平來看，在ASMS海報上還可看到越來越多的中國科學家的名字。”
Michael補充說：“我2001年初次來中國時，發現科學家們多在中國國內的期刊上交流，而現在中國有許多科學家的文章發表在Nature、Science等頂級期刊上與全球科學家交流。這是一個巨大的變化，中國已產生各領域世界級的科學領袖。我們正在努力用我們的儀器來支持中國的科學家們在各領域做出更多領導性、開創性的工作。”
布魯克?道爾頓儲備人才提升服務
去年開始，布魯克?道爾頓分出去了新的微生物的部門，談到當前部門在中國的戰略，Rohan、Michael和布魯克?道爾頓中國北區銷售經理魯靜談到了幾點。
從市場來講，中國是布魯克在亞太地區最重要的市場，也是布魯克服務的最優先的市場。中國市場對布魯克有非常重要的戰略意義，在中國的銷售業績和增長對于布魯克實現戰略目標非常重要。對于布魯克來說，從單個國家來說，中國每年都保持兩位數增長，是全球第二大國家。
近三年布魯克質譜部推出大量高端產品，未來重點是在高端科研市場上。中國的售后服務和技術支持的隊伍和力量都在加強。魯靜表示：“以前我們是銷售驅動，產品銷售了才會去培訓售后服務和技術支持的人員；而現在最大的一個變化是：先進行人才技術培養和儲備，然后才開始大規模的銷售。售后服務的團隊近年來都比較穩定，并在增加新的人手。我們送售后服務和應用支持人員到工廠培訓，每人年均3次以上，這是因為相比在國內的培訓，在工廠的培訓會更更專業、更深入。
中國的業務亦圍繞布魯克整體發展方向來開展。我們第一步要做的工作就是為客戶做好后勤保障，售后服務和技術支持。目前，絕大多數用戶對布魯克?道爾頓售后服務和技術支持的印象已有很大的改觀，我們也收到了很多表彰。”
參考文獻：
1.Trapped ion mobility spectrometry (TIMS) and parallel accumulation -serial fragmentation (PASEF) enable in-depth lipidomics from minimal sample amounts. Matthias Mann等，bioRxiv preprint first posted online May. 31, 2019； doi: http://dx.doi.org/10.1101/654491
2. Parallel accumulation – serial fragmentation combined with data-independent acquisition (diaPASEF): Bottom-up proteomics with near optimal ion usage. Ruedi Aebersold, Ben C. Collins, Hannes L. R?st, Matthias Mann等，bioRxiv preprint first posted online May. 31, 2019； doi: http://dx.doi.org/10.1101/656207
3. MaxQuant software for ion mobility enhanced shotgun proteomics. Jürgen Cox等，bioRxiv preprint first posted online May. 27, 2019； doi: http://dx.doi.org/10.1101/651760
4. Simplified high-throughput methods for deep proteome analysis on the timsTOF Pro. Andrew I Webb等，doi: https://doi.org/10.1101/657908
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