摘要：單細胞多點同步記錄技術在國內外已經被廣泛應用, 但在國內仍缺乏與國產或日產細胞電生理記錄儀器相匹配的多通道同步生物電信號采集與分析系統。本文介紹了新近研制的可進行雙通道甚至更多通道細胞電生理信號采集的神經細胞電生理信號采集與分析系統, 及其關鍵技術及實現方法和應用實例。
單細胞電生理記錄技術是神經科學研究領域中的重要研究手段, 可以用于兩個或者兩個以上記錄點的神經信號同步分析與研究。國際上, 多通道單細胞活動同步記錄技術應用比較普遍, 所用計算機信號采集和處理系統為技術較成熟的專業系統[1~3]。近20年來, 我國部分科學工作者也采用了類似技術研究不同類型神經元和心肌細胞的電生理特性, 所用計算機信息采集和處理系統為ＴＱ－１９醫用數據處理機[4，5]和自研的多功能電生理處理機[6]。目前, 國內仍然缺乏技術上較為成熟的多通道細胞電生理信號同步采集和處理系統。盡管目前美國Axon公司、澳大利亞AD Instrument公司、德國HEKA公司等系列產品中有功能強大的與Patch Clamp放大器配套使用的多通道gap free信息采集系統, 但由于這些信息采集系統與外來儀器的兼容性較差, 價格昂貴, 而且國內公司起步較晚, 生產的儀器性能與國外的相比還存在一定差距, 現有的一些產品已無法滿足神經生理學研究的需要。所以, 雖然目前我國的多數細胞電生理實驗室不乏多種國產的和日本產的細胞微電極記錄裝置, 但缺乏與之相匹配的計算機生物電信號采集系統, 尤其是多通道同步記錄與采集分析系統。為此, 華中科技大學生物物理與生物化學研究所和湖北醫科大學生理學教研室合作, 共同研制了NeuroLab神經細胞電生理信號采集與分析系統。
1．系統介紹
國內大多數細胞電生理室現有的微電極放大器、前置放大器、示波器和刺激器可以滿足單細胞甚至多細胞同步電生理實驗記錄的需要, NeuroLab I型神經細胞電生理信號采集與分析系統力求與上述系列儀器配套使用, 進行多通道信號同步采集與分析, 主要包含數據采集卡和軟件。本系統為使用Visual C++ 5.0開發的32位應用程序, 運行于win95/98環境下。輸入通道可達到8路(差分)/16路(單端), 采樣頻率可達到100 kHz, A/D轉換器分辨率為12位, 誤差不超過0.04%, 可滿足細胞水平研究時域和頻域的要求; 可發出trigger信號以觸發刺激器產生刺激信號。這套系統不僅可以完成數據的采集和顯示, 對采樣條件進行管理, 把實驗結果直接保存在磁盤中, 也可打印出來進行觀察, 并根據神經生理研究的特點, 提供較豐富的分析功能。實驗數據可被SAS,Sigmaplot,Matlab等通用軟件調用, 實現數據共享。本系統經過綜合測試, 運行穩定, 在生理實驗中與示波器照相結果所作的對比說明, 該系統可以滿足神經細胞水平研究時域和頻域的要求。
2．應用實例
本系統對雙玻璃微電極同步引導的在體大鼠雙背側海馬單個神經元的細胞外放電活動進行了信息采集、儲存與處理分析。
實驗動物的選取及處理 實驗動物選用40~60 d的雄性SD大鼠, 烏垃坦(1 g/kg)腹腔注射麻醉后行氣管插管術。在立體定向儀(SN-3, Nihon Kohden)上固定后, 進行雙側開顱并挑開硬腦膜, 止血后敷一層溫度適宜的4%鹽水瓊脂以保護腦組織。用立體定向儀植入一雙極金屬同芯電極至右背側海馬區, 電極尖端位置是A:3.5~4.0, R:2.5~2.8, H:2.5~3.0, 用以中樞電刺激, 實驗過程中維持動物肛溫在37℃左右。
細胞外單位放電活動的引導 在腹腔注射肌松劑pavulon (0.05 mg/kg), 在人工呼吸下進行雙玻璃微電極同步記錄。電極尖端直徑為0.5~2 μm, 電阻為10~30 MΩ, 電極內充灌0.5 mol/L醋酸鈉的2%滂胺天藍溶液。左右背側海馬電極尖端位置是A:2.5~3.0, R:L 2.5~3.0, H:2.0~3.0。 雙側的單位放電活動分別經兩微電極放大器(7101, 8201, Nihon Kohden)、雙通道前置放大器(FZG-81, 中國科學院上海生理研究所)和示波器(SBR-1)進行處理和顯示。同時分別采用兩臺生物電主放大器(SZF-1, 上海國泰)進行監聽, 雙通道電生理信號經雙通道磁帶錄像機(Philips, VR-HD1000)儲存。 在記錄過程中, 給電刺激(60 Hz, 2 s, 0.4~0.6 mA, 串間隔為5~10 min)以觀察誘發放電活動。而后進行計算機后期采集。記錄完畢后, 采用普魯氏藍法和滂胺天藍法標記電極尖端位置, 組織塊經石蠟切片后進行HE染色來確定電極尖端的位置。
3．系統的關鍵技術及其實現方法[7~9]
數據采集 Windows已成為國內大多數實驗室的主流配置。然而, 這卻給對實時性要求很高的采集系統的開發帶來了新的問題。數據采集的過程通常是: 計算機啟動數據采集, 開始進行A/D轉換, 當A/D轉換完畢后, 采集卡發中斷消息給系統, 系統得到通知后, 就會在中斷程序讀取轉換數據, 保存, 并啟動下一次A/D轉換。我們在進行神經信號的研究時, 對采樣頻率的要求有時可高達100 kHz。而Windows的多任務性則不允許一個應用程序獨占系統資源。若使用上述采集方式, 一個簡單的鼠標或鍵盤敲擊可能就會導致數據的丟失。而Windows給采集系統的開發帶來的另一個問題是: 系統禁止應用程序直接操作硬件。
針對上述Windows的特點, 我們在NeuroLab神經細胞電生理信號采集與分析系統的開發中使用了以下一些技術:
使用VXD來捕獲中斷并進行中斷處理 VXD即虛擬設備驅動程序, 實質上是一種DLL (動態鏈接庫), 是微軟專為Windows制定的設備驅動程序接口規范。我們針對我們的數據采集卡開發了專門的VXD, 以完成所需的對硬件的底層編程。
使用FIFO FIFO是一種先進先出的存儲器件, 在我們的數據采集卡上, 使用了1 K word的FIFO。A/D轉換的數據均先存放在FIFO中, 當FIFO半滿時, 就會向系統發中斷。因此, 采集卡由原有的完成一次A/D 轉換就發一次中斷變為完成512次 A/D轉換才發一次中斷, 大大降低了對系統的響應要求。
采用多線程和雙緩沖技術 我們在內存中開了兩個緩沖區, 當中斷到來時, 先從FIFO中讀取數據, 存入緩沖區A, 直至緩沖區A滿, 則轉將FIFO中的數據存入緩沖區B, 并在屏幕上進行顯示,同時置A滿標志, 將緩沖區A中的數據存盤,如圖2右框所示; 而當緩沖區B滿時, 則轉將FIFO中的數據存入緩沖區A, 并在屏幕上進行顯示,同時置B滿標志, 將緩沖區B中的數據存盤。如圖2所示地進行循環。而上述一系列的操作都是在另一個優先權高于主線程的中斷線程中完成的。
數據的曲線顯示 我們專門開發了一個用來進行數據的曲線顯示的ActiveX控件CurveDisp。ActiveX控件是一種OLE控件, 可在VB, VC, Delphi甚至Internet瀏覽器中使用, 接口像Windows的標準控件一樣簡單。因此, CurveDisp控件不僅使用在本系統中, 也使用在華中科技大學生物物理與生物化學研究所開發的膜片鉗系統, 細胞圖像與生理信號同步采集系統中。
CurveDisp控件全面考慮了神經信號研究的需要, 可顯示多達16個通道的數據。 基于各通道數據是同時采集的, 所有通道以相同的時間比例顯示相同時間區域的數據。每個通道數據的幅度均可以不同的比例縮放, 在不同的幅度范圍內觀察。 為突出某些重要通道, 還可動態調整各個通道所占顯示區域的比例。 為增加觀察的直觀性和方便性, 增加了兩個可由用戶任意拖動的標尺, 每個標尺帶有一個可上下移動的文字框, 文字框中顯示標尺所在點的時間和幅值大小。 通過這兩個標尺可進行簡單的數據分析, 如可由兩標尺間的信號時間差及重復次數, 快速估算出信號的頻率, 同時, 也為以后的區域測量與分析作好了準備。
NeuroLab神經電生理信號采集與分析系統采用了多文檔技術。這樣在系統中, 用戶可以打開多個文件, 即可將不同條件下做出的實驗數據同時打開觀察作對比(圖1)。這對于神經生理研究以及其它的生理學研究都是非常重要的。
數據分析本系統提供了較豐富的分析功能, 如功率譜分析、相關性分析、微分、多種積分、傅立葉變換、濾波等, 并針對神經電生理信號研究提供了事件檢測分析、峰值間隔直方圖、關聯間隔直方圖等方法。
經實驗證明, 本系統已成功應用于雙通道細胞外單位放電同步記錄與分析, 而細胞外信號與細胞內信號相比, 電信號特性相差不大, 隨著實驗條件的改進, 本系統一定可以應用到細胞內單位放電同步記錄與分析。同時, 如將本系統與膜片鉗系統技術相結合, 相信在不久的將來, 可研制出雙通道膜片鉗記錄與分析系統。