【硬菜】分子診斷工具介紹

　　因分子技術具有內在準確性、敏感性、特異性和周轉迅速的特點，帶來了分子診斷行業的快速發展。此外，因為分子診斷技術具有準確性、敏感性和特異性，實驗室人員能夠從很小量的樣本中就可獲得有效的結果。這對法醫檢測領域來說是非常有用的，但同時該技術也可以檢測到目標物質的極低濃度，從而使臨床醫生在極早期階段就能檢測到疾病。

　　產生的結果是，越來越多的公司致力于為特異性基因序列開發分子檢測，并希望將他們出售給診斷實驗室，但這些開發者可能不了解支持實驗室從樣本到結果所需要的完整工作流程的附加工具的需要。本文展示了完成分子診斷檢測和像PCR那樣即將對分子診斷產生變革性影響潛能的一些工具所必須的技術類型。這么多年來，多數分子診斷實驗室的核心技術都集中在檢測DNA或RNA特異性、相對較短部分的方法上，其中這些檢測方法能夠對感染性疾病做出診斷，鑒定出對藥物機制產生影響的特異性基因變體或檢測出與癌癥等疾病有關的基因。

　　該類似檢測的核心部分是擴增技術，如實時定量多聚酶鏈反應（PCR）、轉錄調節擴增、靶向擴增和信號擴增。Sanger測序和DNA片段分析或采用毛細管電泳法的定量擴增等也是分子診斷實驗室的核心技術，而且這些方法的程序中也包括一個擴增步驟。為了能利用DNA和RNA來診斷疾病的檢測，分子診斷實驗室必須運行可得出穩定、有效結果定義明確的工作流程，并擁有一些可使工作流程步驟合理化的特異性工具。基本的工作流程如下：

　　1 . 樣本采集和制備：從樣本中提取出用于檢測的基因材料；

　　2．擴增：基因材料被分離出來后，立即將其擴增到一個能被檢測到的大小，從而進行診斷；

　　3．檢測：一旦產生足夠的靶向材料，光型傳感器就能讀取與檢測的靶向材料有關的信號。信號必須是單一的或是多樣的，以便在一次反應中檢測出多種靶向物質（如多樣檢測）；

　　4．數據分析：對檢測階段產生的信號示值讀數進行分析。將這些數值轉換為實驗室人員隨時可解釋的信息，從而最終為臨床人員提供診斷結果。

　　樣本制備

　　包括樣本提取在內的樣本制備是所有分子檢測中的第一個步驟。樣本制備要分離出關心的核酸（DNA或RNA），并排除患者樣本中所有干擾隨后過程的潛在抑制因素。該過程還包括對核酸的濃縮，并提高檢測到極低濃度目標的能力。

　　患者樣本的類型很大程度上影響樣本的制備方法。常見的分子實驗室檢測樣本類型包括全血、血清、血漿、尿液、糞便、痰、棉簽、新鮮冷凍組織和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織。根據檢測的患者樣本類型不同，需要采用不同的樣本制備方法在不破壞基因物質的情況下成功提取核酸。

　　對患者樣本類型和核酸來源采用不同的提取試劑盒。例如，如果核酸來自于細菌而不是病毒，那應該采用不同的提取方法，原因是提取細菌DNA和提取病毒DNA的化學過程是不同的，而且可能獲取最佳樣本的步驟可能存在不同之處。樣本提取試劑盒甚至可以是DNA和RNA特異性的試劑盒，從而提高某一特殊核酸類型的提取效率。雖然還有一些分子診斷實驗室仍然再使用人工樣本制備方法，但大部分實驗室采用的都是半自動化或全自動樣本制備儀器。自動化通過消除與人工方法相關的操作者特異可變性幫助實驗室獲得更加一致的檢測結果，而且還降低了人工操作的時間。這些特點可以獲得更大的生產力并增加實驗室輸出量。

　　分子診斷實驗室關注的一個重要領域是程序的流程化和高級質量控制（QC）的保證。正確的QC方法對保證準確的檢測結果和傳遞有質量的患者護理是很重要的。儀器的質量控制是從有技術性的樣本提取步驟開始的，確保提取過程正確運轉。已存在的商業可得產品的作用是幫助實驗室保證結果的可靠性。能說明這一點的例子有，模擬必須的患者樣本所需步驟并遵循相同工作流程獲得最準確檢測結果的提取控制。

　　在定量檢測中，當某一重要的結果是基因序列復制數量累加得到的時，用于校準檢測的標準同樣要因以下原因而通過提取是很關鍵的：提取通常會導至一些DNA或RNA的丟失。雖然這種丟失可能是很小的，但PCR的指數式擴增會使得提取中的少量丟失造成復制數量結果的明顯改變。采用通過提取步驟的標準將會保證將因丟失而導至的

　　樣本丟失計算到結果中，那樣患者的樣本檢測結果將會更加準確。

　　擴增和檢測平臺、檢測

　　樣本提取之后，伴隨檢測后的目標擴增是分子診斷工作流程中的下一個步驟。類似TMA的擴增方法是等溫的且不需要溫度周期變化。PCR需要多種加熱和冷卻循環來為分子復制提供核酸模板。這一步驟中需要的工具包括檢測試劑和進行基因材料酶型擴增的儀器。

　　檢測試劑可能含有包括核苷酸在內的一系列材料，酶擴增DNA所必須的引物，檢測特異核酸序列的探針，為反應、緩沖液和更多物質提供能量的酶。

　　熱循環周期擴增發生在熱循環器中，而且根據技術的不同，可能會在擴增后進行檢測（如使用單核苷酸擴展的檢測）。在實時PCR、短串聯重復序列（STR）或微衛星標記檢測情況中，檢測能夠跟擴增同時進行。例如，在疾病控制中心的rRT-PCR流感控制板中應用的生物系統7500快速實時PCR儀器上，擴增步驟中，隨著反應的進行，會產生一個靶向特異性探針的信號檢測監測器。采用類似STR分析的片段擴增檢測中，擴增步驟采用了熒光染色標記的引物，使得擴增后毛細電泳法能夠很容易地進行檢測和片段計算。

　　大多數擴增和檢測儀器都能夠在不同波長下對多種信號進行檢測。例如，上述提到的實時PCR儀器能夠一次性檢測到的顏色刺激物多達5種。有了這些性能，很多分子診斷實驗室都在進行多樣檢測。這些多樣工具能夠對一個試管中同一樣本的多種目標物質進行擴增和檢測。他們還能在同一時間內檢測出不同試管中的幾種不同目標物質。多樣檢測中每個反應的費用能顯著低于僅僅檢測單一一種目標物質的多樣檢測，因此能夠獲得分子診斷實驗室的青睞。

　　對富有經驗的分子診斷實驗室來說，自制（實驗室開發）檢測可能看起來是開發診斷檢測的一個比較便宜的選擇。但是，這樣做會需要額外的時間、金錢和人力來建立驗證所需要的檢測參數，如敏感性、特異性、線性、精確性和準確性。這項工作花費的時間能達數月，而實驗室工作人員通常通過從廠家購買一個FDA認證或批準的診斷檢測并在之后讓該檢測上線的方式來節省金錢和時間。無論實驗室選擇一個自產檢測還是FDA認證或批準的檢測，獨立的質量控制材料在這一過程中是極其重要的。之前已經檢測過的患者樣本可被用于進行一些特征性實驗，但一般來說，患者樣本的可獲得性是非常有限的。通過采用廠家（能按照ISO17511規定生產一致性和可溯源的質控材料）的標準品和質控品，不僅能幫助實驗室建立自己的檢測還能保證檢測按照預期時間進行，并根據不同的分子診斷實驗室標準化報告結果。這些標準品和質控品是510（k）認證的，且能為實驗室主任提供額外的置信和質量水平。

　　軟件工具

　　跟隨擴增和檢測，在丟棄擴增產品后，技師就只剩下數據需要處理了。擴增和檢測儀器有特異性到的軟件程序來連接儀器中的檢測器，并收集實時儀器情況下熱循環過程中的數據或終端PCR和序列或采用毛細電泳法的DNA片段分析應用完成后的數據。技師報告結果之前必須審查被分析過的數據，可完成的數據操作數量取決于儀器、分析軟件和應用程序。有些儀器只簡單地報告數值，而其他的會有一些類似基線標示擴增曲線的調整。對于實驗室開發的檢測來說，大多數數據可輸出到電子制表程序進行分析。分析過程可能包括核查檢測過程符合有效準則、排除異常值并決定用來解釋結果的數值，如平均值和對數值。

　　最后，分子診斷實驗室將根據檢測類型，向患者報告一個定性或定量結果。

　　其他像EDCnet之類的軟件工具能讓實驗室分享上傳數據并分享相同檢測已知參考材料的分子診斷結果，然后將他們的檢測結果與其他實驗室從相同材料中觀察到的檢測結果進行比較（稱為同齡群體比較）。該特征將質量檢測結果傳遞給臨床工作人員中增加了實驗室質量控制的另一個層次。

　　總的解決方案

　　分子實驗室中的擴增型診斷將會繼續是疾病診斷和藥物遺傳學研究的一個主要依靠，但更多的實驗室正寄希望于采用單一儀器完成從樣本輸入到結果輸出整個過程的總的解決方案。將樣本制備、檢測設置、擴增和檢測、數據分析和結果報告集合于一個全自動儀器中是診斷供應商長時間一直要面臨的一個挑戰。有些生產廠家已經成功實現了這些。例如，Cepheid的GeneXpert系統和Gen-Probe的Tigris系統已經將提取、擴增和檢測集成到一個單一平臺上。其他廠家雖然也已聯合了類似樣本制備和檢測設置等的一些步驟，但擴增和檢測步驟仍需要用單獨的儀器進行。生產廠家越接近總的解決方案，系統為分子診斷實驗室提供的價值定位也就越高。

　　未來的分子工具

　　分子診斷被廣泛用于血液和感染性疾病中，并在少數情況下被用于基因篩查。目前分子診斷的應用包括利用病毒量監測來評價抗病毒藥物治療的效果、性傳播疾病的診斷以及基因分型。

　　雖然基因篩查只是分子診斷中一個比較小的領域，但其在腫瘤、基因表達分析、個性化診斷和藥物基因檢測學領域中的應用迅速增長。這些趨勢是個性化患者護理醫療方法的一部分，該領域的技術工具正集合于診斷范圍內。

　　利用基因變異的預后評估來測定患者對疾病情況的敏感性仍是診斷專家感興趣的問題。處于某種遺傳性疾病風險或從癌癥治療中恢復但無癥狀的患者可能需要經過基因篩查來主動控制情況發展。隨著臨床應用基因標志物來預測哪些患者可能會對藥物（分別是Herceptin, Erbitux,和Vectibix）治療出現反應，FDA已經要求在藥物標簽、指導臨床醫生讓患者接受分子檢測來指導治療決策方面做出改變。其中臨床應用的基因標志物有人表皮生長因子受體2（Her2）、上皮生長因子受體（EGFR）和V-Ki-ras2 Kirsten ras肉瘤病毒致癌基因同系物（KRAS）。來自生命科學領域的技術現在已為臨床工作者提供了大量豐富的數據和信息，將很快成為診斷方法中的主要部分。例如，轉移基因組學研究所和美國腫瘤學協會進行臨床研究的目標是找到一個利用DNA序列數據在三倍體陰性乳腺癌患者中指導癌癥治療決策。當這些技術被證明安全后，將對醫療保健和實驗室給臨床醫生提供的檢測結果產生深刻的影響。