1.實驗試劑
(1)RNA提取緩沖液(CTAB):2% CTAB(W/V),2% 聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC處理的水配置),25mM EDTA,0.5g/L 亞精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巰基乙醇(V/V,使用前加入).由于在高溫滅菌條件下,Tris-HCl要和DEPC發生反應,所以配RNA提取緩沖液時直接用DEPC 處理的水配制即可
(2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA
(3)10M LiCl 直接用蒸餾水配10M LiCl,加1‰的DEPC過夜后,高溫滅菌
(4)3M NaAc
(5)氯仿:異戊醇(24:1)
(6)酚(pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)
(7)DEPC處理水 用1‰的DEPC處理蒸餾水過夜,高溫滅菌
(8)無水乙醇；70%酒精
2.實驗步驟
(1)實驗開始前將RNA提取液于65℃水浴鍋中預熱,離心管中加入ME(巰基乙醇),(10mL加80ul,50mL中加入300ul)
(2)取約0.8g菌絲體(液體培養獲得的菌絲用真空抽濾即可!固體培養就更好說了),在液氮中迅速磨成精細粉末,裝入50mL離心管,按1g材料8mL的量加入預熱的RNA提取液,顛倒混勻
(3)65℃水浴3-10 min,期間混勻2-3次
(4)加入等體積的酚(注意是酸酚pH4.5):氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(5)取上清,等體積的氯仿:異戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)
(6)加入1/4V體積10M LiCl溶液,4℃放置6h以上(或過夜)
(7)10,000rpm,4℃離心20min
(8)棄上清,用500ul SSTE溶解沉淀
(9)酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提兩次,氯仿:異戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)
(10)加2V體積的無水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上
(11)12,000rpm,4℃離心20 min
(12)棄上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥
(13)加200ul的DEPC處理水溶解
(14)用非變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計掃描檢測RNA的質量
(在抽提過程中,若蛋白質含量或其它的雜質還較多,可以增加抽提次數)
注意:提取RNA請盡量在低溫下操作,如果條件不容許,在室溫下操作的時間要盡可能的短.