【盤點】單細胞測序研究進展一覽

　　細胞是生物學的基本單位，近年來研究人員正努力地嘗試將它們進行單個分離、研究和比較。而應用而生的就是單細胞測序技術，該技術是指DNA研究中涉及測序單細胞微生物相對簡單的基因組，更大更復雜的人類細胞基因組。而隨著測序成本的大幅度下降，破譯來自單細胞的30億堿基的基因組并對逐個細胞進行序列比較已經開始變為現實。

　　單細胞測序技術可謂是科技發展史上的一大創舉。一個細胞里的DNA或RNA僅僅處在皮克級的水平，這么少的量遠遠達不到現有測序儀的最低上樣需求。因此科學家們必須先對單細胞內的微量核酸分子進行擴增，而且必須保證盡可能少地出現技術誤差，以便開展后續的測序及其他研究。最近，來自斯坦福大學的研究者就在PNAS上發表文章介紹了人類腦細胞的單細胞轉錄組測序研究成果，這些結果為構建人類大腦的細胞圖譜奠定了基礎，而且研究結果還將有助于我們確定神經元、膠質細胞和血管細胞的特定標志物，并將其與其他信息相關聯，以便完全闡明人類大腦的細胞復雜性。

　　本文中小編盤點了近年來單細胞測序技術研究的進展情況。

　　【1】PNAS：單細胞測序技術應用于癌癥無創診斷

　　著名學術期刊美國《國家科學院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)在線發表了北京大學生命科學學院生物動態光學成像中心謝曉亮、白凡課題組與北大腫瘤醫院王潔團隊合作的研究結果。在題為“Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients”的研究論文中，研究人員通過單細胞基因測序手段首次報道了對于癌癥病人單個外周血循環腫瘤細胞的全基因組、外顯子組測序結果，此項研究對于揭示癌癥轉移的分子機制具有重要意義，同時還為無創癌癥診斷提供了一種新的技術手段。

　　腫瘤的轉移是導致癌癥病人死亡的主要原因。早在1896年，澳大利亞籍醫生Ashworth首次在癌癥病人血液樣品中觀察到循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell， CTC）的存在。在腫瘤轉移過程中，癌細胞從原發腫瘤脫落，進入血液或淋巴循環系統，其中一些具有高度轉移潛能的腫瘤細胞在循環系統中存活下來，成為循環腫瘤細胞，并進一步發展為遠端器官轉移腫瘤。循環腫瘤細胞是腫瘤發生遠處轉移的必經步驟，因此在外周血中檢測到腫瘤細胞預示著有發生腫瘤轉移的可能。

　　【2】Nature：單細胞DNA測序揭示微生物“暗物質”

　　天文學家們認為，宇宙總物質量的23%由彌漫于其間且肉眼看不見的“暗物質”組成；現在，美國科學家進行了微生物“暗物質”研究，他們用單細胞DNA測序技術對多種微生物的基因組進行測序后發現，微生物遠比我們所知道的要豐富多樣，研究同時揭示了不同物種間令人驚奇的關聯。

　　單細胞測序技術使科學家們能通過將單細胞的DNA增大10億倍來破譯其基因組，為研究微生物“暗物質”打開了大門，也有助于厘清微生物之間以及它們與其他物種之間的關聯。美國能源部下屬聯合基因組研究所的譚佳·沃克領導的研究團隊選擇了201種微生物和古生細菌的細胞，并閱讀了其部分基因組（從10%到90%不等，取決于不同細胞）。這些微生物來源于9種不同的生存環境，包括海底熱水流火山口以及地下金礦等，沒有一種曾被測序或在實驗室內培養過。

　　研究表明，不同生命之間的很多邊界并不像以前所認為的那樣固若金湯。例如，一種微生物系使用以前被認為僅僅在古生細菌中存在的酶合成出了DNA和RNA的基礎組成部分——嘌呤堿基。研究還顯示，有3個古生細菌細胞內存在主要作用是啟動RNA轉錄（是蛋白質生物合成的第一步）的西格瑪因子，而以前，科學家們認為這些西格瑪因子僅出現在細菌體內。

　　【3】單細胞測序助力中科院刊發《science》 表觀遺傳研究取得重大突破

　　單細胞測序解決了用組織樣本測序或樣本稀少時無法解決的細胞異質性難題，正日益成為科研熱點，尤其是在生殖領域的研究中大放異彩。近日，安諾基因與動物所周琪、段恩奎研究組以及上海生命科學院營養所翟琦巍研究組合作，在高脂飲食誘導的父代肥胖小鼠模型中，發現一類成熟精子中高度富集的小RNA（tsRNAs）可為一種表觀遺傳信息的載體，將高脂誘導的父代代謝紊亂表型傳遞給子代，成果發表于Science。

　　很多證據表明，上一代在環境壓力下產生的某些獲得性性狀可以"記憶"在配子中并遺傳給下一代。隨著人類生活環境和生活/飲食習慣的巨大改變，這種獲得性遺傳形式對人類繁衍及子孫健康具有深遠的影響。這種獲得性性狀的跨代遺傳涉及DNA序列之外的表觀遺傳信息在配子中的存儲及傳遞，而破解這些表觀遺傳信息是本領域的一個主要挑戰。

　　【4】Nature：如何利用單細胞mRNA測序發現罕見細胞類型？

　　近日，來自荷蘭的科學家在著名國際學術期刊nature上發表了一項最新研究進展，他們利用一種新的計算方法結合轉錄組測序發現了小腸中一些罕見的細胞類型，這對于深入了解器官的細胞組成，探究健康和疾病狀態下的組織生物學具有重要意義。

　　理解一個器官的發育和功能需要對組成該器官的所有細胞類型的特性有一個清晰的認識。傳統發現和分離細胞亞群的方法是基于幾個已知的標記基因表達出來的信使RNA或蛋白質實現的。但是對于一些罕見的細胞類型來說，鑒定出它們特定的標記基因目前仍存在很大挑戰。而發現一些罕見的細胞類型，如干細胞，短暫存在的前體細胞，癌癥干細胞或循環腫瘤細胞，對于深入理解正常和疾病狀態下的組織生物學具有非常重要的意義。

　　【5】Science：單細胞分析？并行測序技術可以

　　近日，一項發表于國際雜志Science上的研究論文中，來自美國的研究者描述了一種新型的大規模并行技術，通過利用新一代測序技術來在單細胞水平上實現對基因表達的監測；研究者表示，單細胞分析對于理解人類造血系統的必要性及重要性不斷凸顯，如果沒有這種分析的話，來自少許細胞的大量表達改變就和來自許多細胞的小型表達改變就會變得一樣沒有差別。

　　文章中，研究者描述的這種“基于基因表達細胞計數的簡單方法”是利用細胞和分子特異性的條形碼來使得數萬個基因或者成千上萬個細胞被同時進行研究；單一的細胞和包含引物的顆粒會被置于微孔板中，當細胞被裂解后mRNA就會同顆粒上的條形碼引物進行雜交，這種顆粒可以實現磁性恢復并且移動到小管中進行反向轉錄和擴增，隨后再進行新一代測序分析。

　　研究者Christina Fan說道，對擴增產物進行測序揭示了一種細胞標簽、分子索引以及基因的身份，而計算機分析可以對基于細胞標簽的測定序列進行聚合，從而利用相同的分子索引及基因測序信息對其進行拆解，進而實現對每一個細胞的每一個基因確定其完全的轉錄數量。這種特殊的標簽策略及大量的并行技術就可以使得對基因活性的單細胞分子變得可行，從而使得任何研究者都可以利用該方法進行分析。

　　【6】Science：單細胞測序顯示：同一個人的不同神經元DNA序列不一樣

　　之前大家一直認為一個人體內的每個細胞都有相同的遺傳信息，基因組的特殊表達模式使得不同細胞的功能各異。然而最近發表在Science雜志上的文章推翻了該觀點。

　　確定一個人的不同神經元的基因組只能采用單細胞基因組測序的方法。索爾克研究所的科學家采用單細胞基因組測序的方法發現同一個人中不同的神經元基因組存在多樣性。

　　該文章的通訊作者Fred Gage博士稱，與我們之前的想法不同，不同神經元的遺傳標記并不相同，神經元基因組是由不同的DNA片段拼接起來的。

　　科學家從三位死者體內分離了一百個神經元，采用單細胞測序技術，科學家試圖尋找DNA拷貝數的變異性（copy number variations，CNVs）。結果顯示41%的神經元擁有獨特的CNV，這表明這些神經元并不是來自于同一個親本。

　　Gage博士稱，我們發現一個人的不同神經元DNA序列不一樣，該結果讓我們非常驚異，我們必須要設計對照試驗表明該現象不是試驗操作造成的假象。

　　【7】Nature：單細胞測序技術研究癌變腫瘤

　　來自冷泉港實驗室、德州大學MD安德森癌癥研究中心等處的研究人員提出了一種分析研究癌變腫瘤的新方法，并且研究人員還發現腫瘤可能并不是逐步演變的，而是間斷性發生的。這對于腫瘤發生、轉移研究具有重要的意義，也有助于臨床腫瘤診斷。這一研究成果公布在《自然》在線版上。

　　領導這一研究的是冷泉港實驗室著名遺傳學專家Michael Wigler教授，他曾揭示過自閉癥的遺傳機理，人類基因組的大范圍變異，以及乳腺癌分子機理等重要的疾病機理。

　　這種由冷泉港實驗室開發的分析方法就是單細胞測序技術（single cell sequencing，SNS），這種方法能準確定量一個單細胞核中基因拷貝數目。癌細胞中，基因組部分被刪除，或者擴增，從而引起關鍵基因的缺失，或者表達過量，干擾正常細胞生長，因此利用這種方法就能分析基因拷貝數目，從而診斷癌癥。

　　Wigler教授認為，“這項研究證明我們能通過對癌變腫瘤中的一個單細胞進行測序，獲得精確的高通量拷貝數”，“檢查同一癌癥的多個細胞，我們就能了解這種癌癥是如何發生與擴散的”。

　　【8】陸思嘉博士：單細胞測序技術在輔助生殖中的應用

　　12月3日，由生物谷主辦的2015下一代測序發展論壇：行業探討與臨床應用于上海斯波特大酒店隆重召開。江蘇億康基因科技有限公司共同創始人，總經理陸思嘉博士參加了會議并為我們介紹"單細胞測序技術在輔助生殖中的應用"。

　　陸博士作為多次退火環狀循環擴增（MALBAC）技術的發明人，在單細胞全基因組測序方面取得了突破性進展。報告中，他就單細胞測序技術的難點--全基因組擴增技術（WGA）進行講解，對目前的三種WGA技術進行比較，DOP-PCR的覆蓋率不高，MDA的均勻性不好，MALBAC顯著提高了擴增的均勻性和精確性，能在低測序深度的情況下精確地鑒定23對染色體中的染色體異常，能對染色體小片段的拷貝數異常進行檢測，能對已經確定致病基因位點的單基因疾病進行精確診斷。

　　隨著生育障礙人群的不斷擴大，試管嬰兒技術越來越受到關注，但目前試管嬰兒的活胎分娩率在40%左右，在胚胎植入前進行遺傳學篩查和診斷，選擇無染色體異常的健康胚胎植入，能顯著提高試管嬰兒成功率。因此陸博士帶領團隊將MALBAC技術應用于生殖細胞的單細胞水平全基因組測序，在單細胞水平下全面衡量遺傳信息，開展胚胎植入前遺傳學診斷（PGD）和胚胎植入前遺傳學篩查（PGS）。

　　【9】單細胞測序再創新突破，安諾基因建立國內首家基因組與轉錄組平行測序技術平臺

　　2015年4月27日，Nature Methods雜志上發布了一項引人注目的測序技術，基因組與轉錄組平行測序(Genome and Transcriptome Sequencing， G&T Seq)。該技術實現了對單個細胞內的DNA和RNA平行測序，能夠展現單個細胞的基因變異與基因功能之間的關系。作為國內單細胞測序技術整體解決方案的領導者，安諾基因也一直在此方向投入研發，目前也已成功建立了此高難度技術體系，實現單細胞基因組與轉錄組平行測序，進一步完善了安諾基因在國內首家推出的單細胞多組學研究解決方案。談及在單細胞測序技術領域的不斷建樹與突破，總裁陳重建博士表示，單細胞測序技術已經成為科研中的核心應用手段，而全新的單細胞基因組與轉錄組平行測序技術(G&T-Seq)，將有助于我們在更多的生命科學研究上取得一些原創性發現。該技術的推出也進一步奠定了安諾基因在此領域的領先地位。

　　【10】北大首次將單細胞測序用于癌癥無創診斷

　　著名學術期刊美國《國家科學院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences USA)在線發表了北京大學生命科學學院生物動態光學成像中心謝曉亮、白凡課題組與北大腫瘤醫院王潔團隊合作的研究結果。在題為“Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients”的研究論文中，研究人員通過單細胞基因測序手段首次報道了對于癌癥病人單個外周血循環腫瘤細胞的全基因組、外顯子組測序結果，此項研究對于揭示癌癥轉移的分子機制具有重要意義，同時還為無創癌癥診斷提供了一種新的技術手段。

　　腫瘤的轉移是導致癌癥病人死亡的主要原因。早在1896年，澳大利亞籍醫生Ashworth首次在癌癥病人血液樣品中觀察到循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cell， CTC）的存在。在腫瘤轉移過程中，癌細胞從原發腫瘤脫落，進入血液或淋巴循環系統，其中一些具有高度轉移潛能的腫瘤細胞在循環系統中存活下來，成為循環腫瘤細胞，并進一步發展為遠端器官轉移腫瘤。循環腫瘤細胞是腫瘤發生遠處轉移的必經步驟，因此在外周血中檢測到腫瘤細胞預示著有發生腫瘤轉移的可能。

　　【11】北大教授開發單細胞全轉錄組測序新技術

　　北京大學生物動態光學成像中心黃巖誼、湯富酬課題組在《美國科學院院刊》(PNAS)上發表題為“Microfluidic single-cell whole-transcriptome sequencing”的論文。該研究利用微流控芯片技術實現了高質量單細胞的全轉錄組測序樣品準備，全面提高了單細胞全轉錄組分析的準確性和可靠性。

　　細胞是生命活動的基本功能單位，而在生物體內沒有任何兩個細胞是完全相同的。傳統的生命科學與醫學研究，絕大多數情況下都是針對混合的大量細胞進行的，無法觀察到單個細胞之間細微的差別。近年來不斷發展的實驗技術，提供了更加定量與客觀的證據，表明在許多關鍵生命過程例如胚胎發育、細胞分化、疾病發生與發展等過程中，特定的單個細胞行為，以及其間的個體化差異與異質性，導致了極其重要甚至是決定性的結果。而之前基于大量細胞平均測量所獲得的結果并無法正確反映復雜生物體系的全面真實信息，嚴重掩蓋了獨立個體樣本的行為以及生命現象中大量存在的隨機行為。針對單個細胞的研究，是細胞生命分析技術所追求的極限狀態，是對傳統技術極大的挑戰。