皮層／海馬神經元的原代培養

實驗方法原理

神經元在發育過程中早于膠質細胞，因此通常選擇胎鼠做腦內神經元培養。一般取El7-l8d孕大鼠或El4-16d孕小鼠做神經元培養。新生1d的仔鼠也可以用來培養神經元，但培養成功后雜細胞較多，有時需要進一步純化。這兩個部位的細胞培養方法類似

實驗材料 El7-18d孕大鼠或E14-16d孕小鼠新生Id的仔鼠

試劑、試劑盒 含10%胎牛血清的DMEM培養基神經元維持培養基(Neurobasal+B27+谷氨酰胺）

儀器、耗材 培養瓶

實驗步驟

1.根據離心前細胞計數的結果，先用少量神經元維持培養基重懸細胞，充分重懸后，補加液體至合適體積，按照(2-4)x104/cm2的密度在培養板、玻片等介質上接種細胞，并置于37℃孵箱培養。

2.培養過程中接觸細胞要注意動作輕柔，接種Id后應避免把細胞從孵箱中拿出，可根據培養液的顏色和亮度觀察污染情況（污染的細胞，培養液混濁、發黃；正常應該是清亮透明的）。3d后1/3量換液，并可利用神經元標志物的免疫化學染色鑒定純度。第5天起每隔2d 1/2量換液，并可以根據神經元的成熟程度用于實驗。

3.如果覺得神經元純度達不到實驗的要求，可以添加阿糖胞苷（終濃度為5μM),作用2d后，1/2量換液，逐漸去除。

培養成功的神經元，無污染，相差顯微鏡下細胞折光性好，細胞碎片很少或沒有，突起長，培養基清亮，細胞有一定的間距，沒有成團存在，分布均勻，而且沒有太多的雜細胞。培養不太好的細胞，雜細胞多，神經元狀態一般或很差，細胞碎片較多

注意事項

1.神經元培養時常為1/2量換液，在換液前應將培養液在37℃水浴鍋中充分復溫，冷刺激和全量換液刺激都會使細胞活力下降。

2.鼠齡越大，其神經元的培養，操作越要輕柔精細，關鍵在于消化過程和吹打過程。消化時間、吹打次數對細胞活力的影響在原代培養中是最大的。在保證可以獲得足夠單細胞懸液的前提下，應適當縮短操作時間和步驟。

3.海馬和皮層神經元的培養沒有大的區別，皮層細胞豐富，很容易收集細胞，但是雜細胞較多。

4.利用孕鼠做神經元的培養，純度高于新生鼠，而且活力更好。培養海馬神經元時，孕期不足，海馬尚未完全形成，較難分離，但是取皮層就沒關系了。

其他

實驗心得：

1.應用阿糖胞甘作用于神經元，細胞純度會高一些。1/2量換液去除時，雖然會存在殘留，但是這樣的濃度對神經元活性的作用基本可以忽略。

2.在包被玻片時，習慣將8片玻片置于已加入2ml PLL的小皿中，一片一片的加，加完后用彎管小心吹勻，蓋上皿蓋后，輕輕震搖。再放入孵箱包被過夜。包被結束后，以無菌水漂洗2遍，并以彎攝一片一片的夾出來，置于已滅菌的紗布上，超凈臺內吹干。

3.接種細胞爬片時，先以(2-4)X105/100μL的濃度配好單細胞懸液，在玻片上接種100μL,靜置20min后，移至培養箱培養，2-3h后補液至400μL。這種方法接種的細胞能夠均勻分布于爬片上。

4.為了避免長時間培養出現培養液變干的情況，可以在培養板每孔之間的間隙加無菌水。