白細胞介素2的制備及鑒定實驗

實驗概要

本實驗制備了白細胞介素2(IL2)，并進行了鑒定實驗。IL2是Th細胞受有絲分裂原或特異性抗原刺激后，并在白細胞介素1的輔助下，產生的一種可溶性糖蛋白。IL2是體內重要的廣譜免疫增強因子，臨床上常用于治療免疫缺陷病及腫瘤等。

實驗步驟

1. 制備粗制IL2無菌采血，肝素抗凝，用RPMI1640按1:1將血液稀釋，然后重層于菲可液面上，以1 500r/min離心30min，取白細胞層，用RPMI1640洗2次，按1～3×10⁶細胞/ml濃度加入10%胎牛血清RPMI1640，注入一裝有磁棒的大瓶中，置37℃攪拌培養4天，取出，分裝于50ml離心管中，1 500r/min離心20min，棄上清液，將細胞懸浮于1%胎牛血清RPMI1640培養液中，使細胞濃度為10⁶細胞/ml。同時加入純質PHA1～2μg/ml以及多種B淋巴母細胞株，使其濃度為10⁶細胞/ml，37℃攪拌培養18～24h后，取出以1 500r/min離心30min，取上清，用0.45μm濾膜過濾除菌，濾液即為粗制IL2。

2. 制備精品IL2

   1) 硫酸銨沉淀與真空濃縮透析：在4℃下將硫酸銨粉末按50%飽和量加入上述粗制IL2中，攪拌2h，12 000g離心30min，取上清液，再加入80%飽和硫酸銨，4℃過夜，次日以12 000g離心30min，棄上清液，將沉淀溶于01% PEG 6 000的1:2 PBS溶液(pH值73)中，置真空負壓濃縮透析器中透析濃縮至所需容量。

   2) Sephadex G100凝膠過濾：用2×18cm的過濾柱及PBS(同上)，以80ml/h流速過濾。將各管洗脫液用紫外分光光度計280nm檢測其OD值。同時將幾種不同分子量的標準蛋白也用相同條件過濾及檢測其OD值，繪出IL2及標準蛋白OD值的曲線。將各管洗脫液過濾除菌后，作白細胞生物活性試驗，按試驗結果繪出曲線，找出具有最高IL2活性的幾管洗脫液，混合后，作下一步精制。

   3) BlueSepharose層析：將上述混合后的洗脫液加入BlueSepharose柱中，流速約15ml/h，按每管10ml收集流出液，當樣品全部流出柱中以后，用上述PBS洗滌樣品柱，再用梯度NaCl溶液(從0.075mol/L至0.6mol/L NaCl的PBS溶液)洗脫，按2ml/管收集洗脫液。NaCl 溶液梯度及流速均由梯度混合器調節控制。洗脫完畢后，作各管OD值及NaCl濃度的測定。各管洗脫液過濾除菌后，作出生物活性測定。將峰值前后的數管洗脫液混合，即為精制的IL2。置-20℃冰箱保存。

3. 檢定

   1) 活性測定用10%胎牛血清RPMI1640將上述IL2稀釋為50%、25%、125%、625%，而后再將每個百分濃度以及100%濃度的IL2倍比稀釋，自1:2至1:128，將每個稀釋度分別加入多孔板的孔中，每孔0.1ml。然后取CT6細胞株(小鼠的IL2依賴性T細胞株)，調整濃度為10⁶細胞/ml，每孔加入0.1ml，同時用培養基代替IL2作對照。將多孔板培養24h后，取出按每孔1μM的濃度加H³標記胸腺嘧啶核苷繼續培養4h。取出后用MESHⅡ細胞收集器過濾洗滌細胞，用β計數器測定各孔細胞的cpm。必要時按此結果繪出曲線，確定活性單位。

   2) 蛋白含量測定采用分光光度計，分別測得OD280及OD260，然后按下式計算：蛋白含量(mg/ml)=(144×OD280-075×OD260)×稀釋倍數

   3) 毒性試驗及細菌檢查參考胸腺肽制備部分。

注意事項

IL2的制備過程類似細胞培養的過程，因此，其注意事項也類似細胞培養。IL2活性測定采用的是同位素摻入法，因此須按要求操作，防止同位素擴散和污染。