病毒顆粒的等電位滴定曲線用于指導離子交換層析工藝開發
病毒顆粒的等電位滴定曲線用于指導離子交換層析工藝開發
S. Herzer1, P. Beckett 1 , T. Wegman 2, and P. Moore1
1Amersham Biosciences Corp, Piscataway, NJ, USA; 2Mayo Clinic, Rochester, MN, USA
使用電泳滴定曲線（ETC）測定病毒顆粒的電荷性質，是層析純化法過程中的一個部分。病毒顆粒的CyDye? 標記和使用Typhoon?掃描儀對其在凝膠中的檢測是一種快速且靈敏的工具，可以用于預測完整病毒在離子交換柱上的層析行為。ETC結果有助于離子交換介質和分離條件的選擇。 本文報告了腺病毒和麻疹病毒的結果。該方法也適用于腺相關病毒（AAV）、鼠白血病病毒和細菌噬菌體如lambda和M13等。
前言
電泳滴定曲線（ETC）是測定預置的pH范圍內生物分子電荷性質的強有力的工具。蛋白質混合物的ETC有大量的參考文獻[1-10] ，并且它們常用于離子交換層析法的評估和預測[1, 7] 。
基因治療和疫苗對大量高純度病毒顆粒的要求，使得層析分離純化倍受關注[11-14] 。病毒顆粒的復雜性和易碎性影響了實驗中對其電荷性質的估計。在pH梯度中的瓊脂糖凝膠電泳具有環境相對溫和的優點。我們在此描述了一種快速、可重復的、敏感的方法，為進行完整病毒顆粒的層析分離確定一個有用的工作pH。
材料
除特殊說明外，包括細菌噬菌體在內的全部材料都來自Amersham Biosciences公司。制備緩沖液的一般化學藥品都來自Sigma, Aldrich。SYPRO? Ruby來自Molecular Probes。所有其他的病毒都來自ATCC，麻疹病毒除外(由Rochester, MN 梅奧診所的M. Federspiel教授友好捐贈）。
方法
CyDye?熒光標記在能保持病毒穩定性的弱堿性pH環境中完成。 為避免過度標記和交聯僅使用單活性基染料。標記環境保持在低的溫度(在冰上）或在短時間內進行，以確保病毒顆粒的表面電荷性質不被過度標記所影響。
其他的步驟都按照制造廠家的說明書進行，除非另有說明。瓊脂糖ETC凝膠中加入5%甘油以防止發生凝集，這種凝集在被掃描的凝膠上顯示為大片彌散。
按照如下程序在PhastSystem?快速凝膠電泳儀上運行瓊脂糖ETC凝膠：第一步，以2000V,20 mA/gel , 15 , 7 W ℃ 經110Vh，以形成pH梯度；在110 Vh時停止電泳，將凝膠旋轉90°。在第一步和第二步期間仔細標記陰極的方向。 應用只包含完整的除去鹽分的病毒顆粒或細胞溶解產物的樣本，使用跨過凝膠的寬度和pH梯度的滴定曲線點樣器或小的切口加樣。病毒樣本在1000V 20 mA/gel, 15 , 7 W ℃ ，經40-60Vh被電荷/pH所分離。經適當設置的Typhoon掃描儀間隔掃描分離的過程。
按照制造廠家的說明書控制瓊脂糖ETC凝膠在快速電泳儀上運行，并在Typhoon掃描儀上用SYPRO Ruby觀察。
層析法使用HiTrap? IEX Selection Kit, RESOURCE? S和 RESOURCE Q柱分離病毒顆粒。選擇根據ETC確定的pH值用于分離，將除鹽的或稀釋的病毒（在> 5 mS/cm時，適當的pH值) 用平衡好的層析柱分離。一般而言，在低強度緩沖液（緩沖液A，如適當pH值的25-50mM Tris)中平衡柱子，用1-3倍柱體積(CV)的病毒上樣。
至少1-2倍CV洗柱，再以10倍CV緩沖液A和梯度到100%緩沖液B洗脫病毒，此處緩沖液B包含適當的鹽分以確保病毒穩定，例如1M NaCl （需要考慮兼容性）。自始至終按照0.25-0.5CV收集組分。
根據病毒的傳染性或利用Sepharose?6 Fast Flow(17-0159-01) 的Triccorn 5/10柱或MicroSpin? S-400 HR Column (27-5140-01)分析收集的組分。用凝膠電泳分析收集的外水體積以確定病毒結合特性。