電泳及轉膜技術

實驗概要

掌握 Southern blotting 的原理及操作步驟

實驗原理

 1．轉膜的方式：

      向上的毛細管轉移

      向下的毛細管轉移

      同時向兩張膜轉移

      電轉移

      真空轉移

 2．固相支持物的種類及選擇：

     硝酸纖維素膜：非共價結合，易脆，易丟失 DNA ， < 500 bp 的 DNA 無效，轉膜前的工作（從提高轉膜效率，利于轉膜后使用等）

     尼龍膜（帶正電荷的）高強度，不易破損，具有較大的 DNA 結合容量，它能夠吸附變性 DNA ，核酸以共價結合方式不可逆的結合在尼龍膜上。尼龍膜兩邊均有吸附 DNA 的功能，無論用哪邊均可以經久耐用，可反復利用 10 次以上（ 10-20 次），經毛細管（毛細吸附）作用，把 DNA 從凝膠上轉到膜上。 DNA 轉到膜上是復制膠上的帶型，在 80-100 ℃真空干燥 2-4 hrs ，即可固定 DNA 。

 3．轉移緩沖液（ transfer buffer ）的選擇：

     帶正電荷的尼龍膜：可用高鹽離子強度（ SSC ），但不能充分發揮膜潛能； 0.4N NaOH ，共價結合 DNA 是最大優點。

     硝酸纖維膜：高鹽離子強度促進 DNA 與膜結合（ 20 × SSC ），低鹽離子強度導致小片段 DNA 在轉移過程中丟失， pH>9 ， DNA 不能與膜結合。

 4．轉膜時間（ duration of transfer ）約 12 hrs

      取決于毛細管系統， DNA 大小，膠厚度 (<5 mm) 及濃度 (<1%) 。

      DNA 分子量大小決定時間長短，部分去嘌呤減小 DNA ，堿轉移 2hrs 大部分結合到膜。

      DNA 轉移的效率較難判斷，只有在轉膜結束后，通過 EB 染膠，及分子雜交才可以鑒別效率高低，但已無補救措施，因此，每一步應嚴格操作。

主要試劑

 0.4N NaOH 

 0.2NHCl 

 瓊脂糖

主要設備

 尼龍膜

 濾紙

 玻板

 電泳槽

實驗材料

酶消化好的 DNA 樣品

實驗步驟

1．0.8% 瓊脂糖電泳

 制膠：注意瓊脂糖的質量，膠的濃度，厚度（<5mm）及均一性。一般大電泳槽配制 250ml 0.8% 瓊脂糖凝膠，采用 42 孔梳子（經濟，高效）

 制樣，點樣： DNA 樣品中指示劑量稍多

 電泳：一般 1-1.5V/cm 的電壓，使 DNA 遷移到適當距離，一般指示劑約移動 10-11cm ( 大電泳槽： 40V × 12-15hrs ，小電泳槽 30V × 4-5 hrs)

2．轉膜前的準備：

依膠大小每塊凝膠準備兩張比膠稍大的濾紙（ 11 × 12.5 cm ），兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜（ 10 × 10.5cm ），兩個玻璃盤、兩塊有機玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊吸水紙等。

3．一玻璃盤中加入足量的 0.4N NaOH ，放上洗凈的玻璃板，按圖示搭制鹽橋 ( 操作示范 ) 。

4．凝膠的預處理：

      a.從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當大小，切去右上角（最后一個樣品的最前端）作為電泳方向記號

      b.把凝膠翻面，放入加有足量 0.2N HCl 的玻璃盤中，輕輕搖動 10min ，使指示劑變黃色為止（脫嘌呤）

      c.倒去 HCl 溶液，加蒸餾水漂洗凝膠

      d.倒去蒸餾水，加 0.4N NaOH 中和

      e.同時在鹽橋濾紙上灑些 0.4N NaOH ，立即將膠放在鹽橋上（忌氣泡）

5．膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（吸水紙與鹽橋相接）

6．在膠面上倒足夠量 0.4N NaOH ，小心放置膜（預濕 0.4N NaOH ）使膜覆蓋整塊膠（要求一次成功，不能移動）

7．膜上放 2 張濾紙，濾紙大小為 15 × 12cm

8．放不少于 5cm 厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約 500g 的重物，轉膜 12 hrs 左右

9．轉膜完畢，用 2 × SSC 漂洗膜兩次，各 5min 。用 EB 染膠以檢測轉移效果。

10．用兩張濾紙包住膜，置于 80-100 ℃的真空干燥箱中，干燥 2-4 hrs 。