甲醇酵母表達注意事項2

6、乙醇沉淀法的問題

主要步驟如下：

1）酶切體系（80ul）中2倍體積的無水乙醇加1/10體積的PH5.2 NaAC，混勻

2)-20℃ 20分鐘沉淀

3)13200rpm，20min，離心后棄上清
4)75%乙醇300ul輕輕洗，同上離心5min，棄上清

5)37度烘箱至無乙醇氣味（或是用搖床的出風口吹出的暖風吹）。

6)20ul ddH2O重溶

如果想提高轉化效率，可以稍微做一些改進：

（1）還是用酚抽一下，去除內切酶；

（2）75%乙醇應洗兩遍，盡可能去除鹽離子，防止電轉化杯被擊穿，同時可提高效率；

（3）在沉淀時，如用終濃度2.5M的醋酸鈉+2.5倍體積的無水乙醇，可沉淀幾乎所有的DNA，但需要用75%的乙醇認真的洗兩遍。

7、酶切的總結

影響重組質粒構建效率的最關鍵步驟在于酶切，不管是否是定向克隆還是非定向克隆。酶切的關鍵在于切干凈，徹底的酶切反應是成功的一半，特別是載體的酶切，尤其是雙酶切。

雙酶切一般是先反應低鹽buffer的、后反應高鹽buffer的，如果低鹽buffer的酶在高鹽buffer的酶的反應條件下有低活性（一般來講在NEB的手冊上都有標示），最好就先純化（酚/氯仿抽提、乙醇沉淀）過，再進行第二次酶切反應。注意：有相同功能（如：切同一序列，并產生相同末端）的酶，不一定是相同的酶（結構、性質不同）。

雙酶切失敗有很多原因，先要看你抽的質粒有沒有問題，你可以用2—3種確定單酶切的酶分別切質粒，如果都只有一條帶就沒問題；

再看你的雙酶切的緩沖液是不是合適，如果你的雙酶切條件不對，就會有大小不同的片斷。有時后提供給你的緩沖液的理論值與實際有很大的差別。建議你回頭檢查一下你的質粒超螺旋是不是很好，酶切實在不行的話，就分開來切，順便檢查你的那一個酶，或者那一個酶切有問題。抽提質粒要注意溶液Ⅱ?處理時間不要超過5分鐘，太長會有部分質粒不能復性，而且酶切不動。

酶切反應成功的前提是對質粒載體的大致定量，太多的載體用量對酶切效率有負面影響，而太少的質粒載體不能保證實驗的需要。

8、如何減少PCR反應中的引物二聚體

減少引物形成二聚體的可能性：

1）退火溫度設置不對，導致引物與模板的結合率降低。

2）引物設計不好，很容易形成二聚體。

如果碰到這種情況，可以嘗試從以下幾個方面解決：

（1）設計引物的時候

首先要熟悉引物設計的一般的原理，參考一些資料，積累經驗。如果條件允許的話，可以用比較靠得住的引物設計軟件驗證我的引物，如果沒問題，則進行下一步。

（2）改變退火溫度

一般引物合成后廠家會提供其Tm值，可以根據這個溫度為基準來做溫度實驗。如果你設計的引物里頭有酶切位點和保護堿基，則此方法不行，可以用比較靠得住的引物設計軟件來計算你引物中與模板結合部分的Tm值，然后以此為基準做溫度實驗。也可以根據自己的實際操作經驗來解決問題。

（3）最后

建議換一下Taq酶，某些進口的Taq酶太嚴謹，導致引物二聚體的形成，這也是可能的。我們試驗中一直都是使用某國產的Taq酶，效果挺理想。