由轉座子插入引起的基因突變

實驗概要

本實驗介紹了由轉座子插入引起基因突變的原理和實驗方法。

實驗原理

轉座子（Tn）是能在不同復制子之間轉移位置的核苷酸順序。它一般來自抗藥性質粒，由一個或幾個抗藥性基因加上兩端兩個順序相同（但是方向不一定相同）的核苷酸片段（稱為插入順序IS）構成。當一個轉座子轉移位置而插入某一基因時，能使這一基因失活，即發生突變。各個轉座子的抗藥性基因、轉移頻率、插入位置、插入順序都可以不同。有些轉座子對于染色體的各個位置插入沒有偏向，而另一些則偏向于插入某些特定的位置。

轉座子的插入突變有兩上表型效應，即基因突變的表型效應和由轉座子帶來的抗藥性。因此利用轉座子可以有效地取得任何一種突變型。一個很有效的方法是通過轉座子誘發F’因子上的染色體基因的插入突變。

大腸桿菌2－2菌株的染色體上攜帶有Tn5轉座子（含kan抗性基因）。要使Tn5插入到F’ Lac Pro /Str^s的乳糖發酵基因中去以引起Lac 突變，可先將這一F’因子轉移到Δ(Lac Pro)Str^r受體細胞中去，再觀察是否發生了插入突變。在能排除供體的含鏈霉素的培養基上選擇Pro 受體菌落，若是抗卡那霉素的，那就是說受體細菌不但接受了F’因子，而且這一F’因子帶有Tn5，如果它又由Lac  變為Lac^-,不能在以乳糖為唯一碳源的培養基上生長，那么，這一插入位置就是在乳糖發酵基因中。

為進一步提高效率，還可以采取一種措施，使在特定條件下Lac 細菌不能生存而Lac^-細菌能夠生存。已經知道galE突變型在有乳糖和半乳糖存在的情況下，由于細胞中積累有毒的半乳糖代謝中間產物UDP－gal和gal-1-P而死亡，所以如果采用galE突變型作為受體細菌，在含有0.02%乳糖和0.2%甘油的基本基上，受體細菌如果接受了一個F’Lac Pro ，就不能生存。如果lac 基因由于插入了Tn5而成為lac ,那么受體細菌便能生存下來。

主要試劑

1. LB完全培養液，每組4支，每支5ml。

2. 無菌生理鹽水，每組6支，每支4.5ml。

3. L選擇培養基：含鏈霉素、卡那霉素、乳糖和甘油的基本培養基，每組6皿。

4. G選擇培養基：含鏈霉素和葡萄糖的基本培養基，每組5皿。

主要設備

1. 37℃搖床

2. 250ml三角瓶

3. 培養皿

4. 超凈工作臺

實驗材料

1. 受體菌：F^-/Δ(lac proB) gaE str^r。

2. 供體菌：F’lac pro /Δ(lac pro)nal^r帶Tn5于染色體某處。

實驗步驟

1. 第一天傍晚，分別接一環供體菌和一環受體菌于兩支5ml LB培養液中，37℃搖床上培養過夜。

2. 第二天，取兩個內含4ml　LB培養液的250ml三角瓶，分別加入1ml過夜培養的供體菌及受體菌，在37℃搖床上培養2-3小時。

3. 將新鮮培養的供體菌及受體菌各取1ml，在一無菌的250ml三角瓶中混合，37℃輕搖60分鐘。

4. 吸取0.5ml混合菌液，用生理鹽水稀釋10^-6倍。

5. 從10^-1倍稀釋液中吸取0.1ml涂于L選擇培養基平板上，將供體菌及受體菌分別吸取0.1ml涂于L培養基上作為對照。再從10^-2、10^-3、10^-6倍稀釋液中各吸0.1ml分別涂于G培養基平板上。37℃培育二天。

6. 觀察、統計并計算：

   1) 接受了供體F’(Lac Pro )的受體菌的數目：G板上生長的菌落數(個/ml)。

   2) 在L板上生長的菌落數（個/ml），即Tn5插入到lac基因上菌落數。

   3) 計算Tn5轉座到lac Z或lacY上的轉座頻率，在L板上生長的菌落數/在G板上生長的菌落數。