通過一種有效的蛋白酶（如蛋白酶 K ) 的消化作用及隨后的酚：氯仿抽提，就能從大規模制備的 λ 噬菌體中很好地分離到 DNA。該方法也適用于小量（50~100 ml ) 制備物。本實驗來源「分子克隆實驗指南第三版」黃培堂等譯。
| 實驗方法原理 | 通過一種有效的蛋白酶（如蛋白酶 K ) 的消化作用及隨后的酚：氯仿抽提，就能從大規模制備的 λ 噬菌體中很好地分離到 DNA。該方法也適用于小量（50~100 ml ) 制備物。 |
|---|
| 實驗材料 | 蛋白酶 K限制性內切核酸酶λ 噬菌體顆粒 |
|---|
| 試劑、試劑盒 | 氯仿透析緩沖液EDTA乙醇酚酚：氯仿SDS乙酸鈉TE |
|---|
| 儀器、耗材 | 瓊脂糖凝膠Sorvall SS-34 轉子或相當型號硼硅酸鹽巴斯德吸管水浴 |
|---|
| 實驗步驟 | 一、材料
1. 緩沖液和溶液
(1) 氯仿
(2) 透析緩沖液
10 mmol/L NaCl
50 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0)
10 mmol/L MgCl2 需要兩份透析緩沖液，每份為噬菌體溶液體積的 1000 倍，室溫保存。
(3) EDTA ( 0.5 mol/L，pH 8.0)
(4) 乙醇
(5) 酚
(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）
(7) SDS (10%，m/V)
(8) 乙酸鈉（3 mol/L，pH 7.0)
(9) TE ( pH 7.6 和 pH 8.0)
2. 酶和緩沖液
蛋白酶 K
限制性內切核酸酶
3. 凝膠
瓊脂糖凝膠（0.7%)，用 0.5X TBE，含 0.5 μg/ml 溴化乙錠
4. 離心機和轉子
Sorvall SS-34 轉子或相當型號
5. 專用設備
硼硅酸鹽巴斯德吸管（密封）或 Shepherd 鉤
透析袋，煮過
預置 56℃ 的水浴
6. 載體和菌株
于 CsCl 懸浮液中的 λ 噬菌體顆粒
二、方法
噬菌體懸浮液的透析
1. 將制備好的噬菌體懸浮液裝入一端打結或用塑料夾進行封閉的透析袋內，然后封住透析袋的另一端，放入含超過 1000 倍的透析緩沖液和一磁力攪拌器的燒杯中，于室溫慢慢攪拌中透析 1 h。
2. 將透析袋轉移至另一裝有新鮮緩沖液的燒杯中，再透析 1 h。
3. 將噬菌體懸浮液轉入聚丙烯離心管中。
不要超過管體積的 1/3。
4. 在透析過的噬菌體懸浮液中加入 0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0) 至終濃度為 20 mmol/L。
噬菌體顆粒的抽提
5. 在懸浮液中加入蛋白酶 K 至終濃度為 50 μg/ml。
6. 加 SDS 至終濃度為 0.5%，通過將離心管輕輕地上下顛倒數次進行混勻。
溶液的外觀將快速改變，從略顯藍色的噬菌體顆粒懸浮液轉變成含病毒 DNA 和病毒外殼蛋白裂解物的清亮溶液。
7. 將消化混合物于 56℃ 溫育 1 h，然后冷卻至室溫。
8. 加入等體積的平衡酚，通過將離心管輕輕上下顛倒數次，混勻有機相和水相，直至形成一完全的乳狀液。
9. 3000 g（5000 r/min 于 Sorvall SS-34 轉子中）室溫離心 5 min 將兩相分離，用寬口吸管將親水相轉移至一干凈離心管中。
10. 用 1:1 的平衡酚和氯仿混合物抽提親水相。
11. 如上所述（步驟 9 ) 回收親水相，用等體積的氯仿重新抽提一次。大規模制備，轉入步驟 12。
小量制備（從 50~100 ml 培養物中制備的噬菌體）
(1) 用標準乙醇沉淀回收噬菌體 DNA。
(2) 將溶液于室溫放置 30 min。
當加入乙醇后，λ 噬菌體 DNA 將出現絲狀沉淀，可用口封住的硼硅酸鹽巴斯德吸管或 Shepherd 鉤從溶液中撈出。
(3) 將 DNA 重新溶解于適當體積的 TE ( pH 7.6) 中，轉入步騾 14。
CsCl 的去除
12. 將親水相轉移至透析袋中。
伊人久久大香线蕉综合影院首页
|
|---|
