| 實驗步驟 | 材料與設備
丙烯酰胺
雙丙烯酰胺
尿素
過硫酸銨（10%;w/v)
N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)
合成的互補寡核苷酸（含待分離序列特異性 DNA 結合蛋白的識別序列)
仲丁醇（2-丁醇)
二乙醚
NaOAc(3mol/L)
MgCl2(1mol/L)
乙醇（100% 和 75%;v/v)
SpeedVac 旋轉濃縮儀（SavantInstruments,Inc.)
試劑
TBE(10x)
甲酰胺加樣緩沖液
TE
(配方，見“試劑的配制”，P.131~138.)
操作程序
聚丙烯酰胺凝膠的制備
1) 制備 20-cm×40-cm×1.5-mm 的凝膠，有 4 個寬 3 cm 的加樣孔。對長度范圍約為 10~45 堿基的寡核苷酸，宜采用 16% 的聚丙烯酰胺/尿素凝膠。對更長的寡核苷酸，可釆用 8% 或 6% 的聚丙烯酰胺/尿素凝膠。
2) 為制備 16% 的聚丙烯酰胺/尿素凝膠，可按如下配方混合：
丙稀酰胺 (38%;w/v)/雙丙烯酰胺 (2%;w/v) 50 ml
TBE(l0x) 12.5 ml
尿素 62.5 g
H20 17 ml
總體積 125 ml
3) 過濾，短暫脫氣，然后加 750ul 10%(w/v) 過硫酸銨和 50ul TEMED。
4) 讓凝膠聚合≥30 min, 再在 30W 下凝膠預電泳至少 1h。
注：凝膠的預電泳有助于去除過量的過硫酸鹽離子，后者會使 DNA 發生降解。
5)—塊凝膠可加的 DNA 童能制備出 1umol(約 1~2 mg) 合成寡核苷酸（所有 4 個 3-cm 加樣孔都用上，每孔含 0.25umol 樣品。這個 DNA 量大約是能加于凝膠而不致超載的最高限量。
注：DMA 在 16% 凝膠中的遷移性如下: 溴酚藍可與長約 10 個堿基的寡核苷酸共遷移，二甲苯腈藍可與長約 30 個堿基的寡核苷酸共遷移，若寡核苷酸的長度為 25~35 個堿基，則建議在甲酰胺加樣緩沖液中只加入溴酚藍。
樣品的制備
1) 用適量甲酰胺加樣緩沖液溶解寡核苷酸, 恰可使 50ul 樣品加入一 3-cm 加樣孔中。
2)65℃ 下加熱樣品 15 min, 以消除 DNA 中的二級結構。
3) 加樣. 并將凝膠置于 30W 下進行電泳。溴酚藍下行至凝膠的 3/4 處約需 4 h, 此條件足以純化長為 15~30 堿基的寡核苷酸。
DNA 的回收
1）紫外 (UV) 造影鑒定主帶 (通常為最大的寡核苷酸，但有時為次大的寡核苷酸)。
注：紫外造影操作如下。將聚丙烯酰胺凝膠置于兩張塑料包裝膜（如 Sarnn 包裝膜）中間，再將凝膠放在一塊含有熒光材料的薄板（如含有熒光色素的薄層層析板或放射自顯影屏）上。用手持式紫外燈將長波長的紫外光照在凝膠上（時間要短！）。除 DNA 帶所在位置外，熒光材料板上的其他所有地方都會觀察到熒光（因為 DNA 能吸收紫外光）。這樣，在 DNA 帶下會出現影子。用鋼筆在 DNA 帶周圍快速劃下輪廓，然后在普通光下切下凝膠中對應的含有 DNA 的部分。
2) 小心地用刀片將 DNA 帶切下，要努力避免將凝膠切碎（不要將膠條研成小碎片）。
3) 將凝膠塊浸泡在 5 mlTE 緩沖液 (于 15-ml 聚丙烯塑料管) 中，于 37℃ 振搖過夜。
4) 于巴氏吸管中通過硅烷化玻璃棉過濾上清液。
注：巴氏吸管中的玻璃棉要預先用約 5 ml 的水浸泡，這很重要。
5) 用仲丁醇反復抽提濃縮 DNA。
6) 用二乙醚抽提 DNA—次，用 SpeedVac 旋轉濃縮器真空去除殘留的乙醚。
7) 用 TE 緩沖液將液體體積調至 180ul
8) 加 20ul 3mol/LNaOAc 和 2ul 1mol/LMgCl2，震蕩混勻。
9) 加 600ul 100% 乙醇，顛倒混勻。干冰/乙醇中（-78℃) 冷卻 10 min。混合物室溫下放置 5 min。室溫下微型離心機高速離心 15 min, 沉淀 DNA。
10) 加 180ulTE 緩沖液，震蕩溶解沉淀。
11) 加 20ul3mol/LNaOAc 和 2ul1mol/LMgCl2, 震蕩混勻。
12) 加 600ul100% 乙醇，顛倒混勻。干冰/乙醇中（-78℃) 冷卻 10 min。混合物室溫下放置 5 min。室溫下微型離心機高速離心 15 min, 沉淀 DNA。
13) 加 800ul75% 乙辭沉淀 DNA, 震蕩混勻。室溫下離心 5 min。
14) 小心地用 SpeedVac 旋轉濃縮器千燥沉淀（當心: 有時靜電會使沉淀脫離離心管)。
15) 將 DNA 溶于 TE 緩沖液，儲存于-20℃ 下。
16) 測量 A260nm 和 A280nm。
注：對于序列特異性 DNA 親和介質，假定 1A260nm 單位=40ug/mlDNA。 展開 |
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