用亞氨基二乙酸（鐵螯合）Sepharose6B分離磷酸肽實驗

EDTA 乙酸銨 乙酸鈉 乙酸 氯化鐵 Tris-HCl Sepharose 6B 柱

SpeedVac 型旋轉濃縮器

材料與設備

Sepharose 6B 柱（1x6 cm;~5 ml), 含亞氨基二乙酸（鐵螯合)，（柱的理論容量為~2umol 的磷蛋白）（Pharmacia Biotech Inc.)

Tris-HCl(50 mmoI/L;pH7.6), 含 EDTA(100 mmol/L) 和 NaCl(500 mmol/L)

氯化鐵（50 mmol/L)

乙酸（0.1mol/L)

乙酸鈉（0.1mol/L，pH 5.0)(即，0.1mol/L 乙酸用 NaOH 調 pH 至 5.0)

乙酸銨（1%;PH6.3 和 pH8.3)

SpeedVac 型旋轉濃縮器（Savant Instruments,Inc.)

EDTA(0.2mol/L;pH8.0)

操作程序

全部操作均在室溫下進行。

1) 用 4 體積（20 ml) 洗亞氨基二乙酸 Sepharose 6B 柱。

2) 用 4 體積含 100 mmol/L EDTA 和 500 mmol/L NaCl 的 50 mmol/L Tris-HCl(pH7.6) 洗柱。

3) 用 4 體積 H₂O 洗柱。

4) 用 4 體積 50 mmol/L 氯化鐵洗柱，以用鐵飽和柱子。

5) 用 2 體積（10 ml)0.1mol/L 乙酸洗柱，去除疏松結合的鐵。

6) 加肽混合物（溶于~4 ml 0.1mol/L 乙酸）于柱上。

7) 用 2 體積的 0.1mol/L 乙酸洗柱，去除未結合的肽。

8) 用 2 體積 0.1 ml/L 乙酸鈉 (pH5.0) 洗柱。

9) 用 3 體積 (15 ml)1% 乙酸銨 (pH6.3) 洗柱。

10) 用 4 體積 1% 乙酸銨 (PH8.3) 洗脫磷酸肽。

11) 分部收集 0.5~1.0-ml樣品。按 pH(點 pH 試紙測定之）合并樣品。用 SpeedVac 型旋轉濃縮器濃縮，分析磷酸肽。

12) 洗脫后，立即用 4 體積的 0.2mol/L EDTA 洗柱。無金屬螯合的柱子可在室溫下保存于 0.2mol/L EDTA（pH8.0) 中，并可重復使用多次。