用于樣品前處理的自動化移液平臺

自動化高通量LC-MS/MS法分析維生素D結合蛋白

本文介紹的工作流程是利用自動化移液工作站進行樣本前處理，96個樣本只需不到20min的時間，與其它樣本制備方法相比， TurboFlow技術能夠明顯改善去除樣品基質組分的效果。

分析血清中總25-羥基維生素D2/D3(簡稱25OHD，結構如圖1)是許多生物實驗室的日常檢驗工作之一，而有越來越多的實驗室選擇用液相色譜與串聯質譜聯用(LC-MS/MS)的方法來實現這一檢測。

與其它樣本制備方法相比，Thermo Scientific TurboFlow技術能夠明顯改善去除樣品基質組分的效果。但在進行LC-MS/MS分析前，仍需進行一些前處理步驟，其中最重要的是完全去除樣本中內源性的維生素D結合蛋白，以及為定量實驗添加內標。以處理96個樣本為例，手工法將會多耗時2h以上。本文介紹的工作流程是利用自動化移液工作站進行樣本前處理，96個樣本只需不到20min。

另外，串聯質譜方法本身對于區分一些25OHD的代謝產物會有困難，比如3-epi-25-羥基維生素D3。為了精確定量25OHD3，LC-MS/MS延長了色譜分析時間，以區分和解析3-表-25-羥基維生素D3。

實驗條件

樣品制備

人血清樣品來自于國際維生素D質量評價體系(DEQAS，樣品404和405)，所有的移液設備均使用Thermo Scientific Versette自動移液工作站。移液流程參見圖2。Versette系統配合96道移液頭和DARTs 300μl加長型槍頭。標準品和質控品(均來自Chromsystem MassChrom 25-Hydroxyvitamin D2/3 Kit)以及樣品(100μl)從1ml Thermo Scientific Nunc Cryobank凍存管中轉移到96孔板。內參溶液(25μl，H6-25OHD3)和沉淀劑(200μl)，均來自于Chromsystem公司，放置于儲液槽內。96孔板先在微孔板振蕩器上振蕩混勻(600rpm，10min)，隨后離心(200g，3min)，上清液收集于新的96孔板內。將板用粘性膜封口后置于Thermo Scientific Transcend TLX-2系統上分析。所有用到的耗材列于表 1。

液相色譜

樣品上清(100μl)在湍流條件下(2ml/min)注射入TurboFlow XL C18柱(50×0.5mm i.d.)。待分析物從TurboFlow柱中反向沖入Thermo Scientific Accucore PFP分析柱(2.6μm粒徑，50×2.1mm i.d.)。

質譜

質譜在Thermo Scientific TSQ Vantage三重四極桿質譜儀上進行。樣品以大氣壓化學電離的方式進樣，每次MS/MS數據分析5min。整個LC時間為14min，如圖7所示。

結果與討論

如圖7所示，25OHD3，3-epi-25OHD3和25OHD2的保留時間分別為10.94min，11.47min和11.82min。總的分析時間為14min，包括柱再平衡時間。樣品405有效分離出了3-epi-25OHD3，而若使用C18柱作為LC-MS/MS中的分析柱來使用的話，這一成分將會被誤認為是25OHD3，因為C18柱不能有效區分異構體。

結論：

Versette自動移液工作站幫助整個實驗流程節約了80%的時間，對于96個樣品的制備來說，從2個小時縮短到不到20min!另外，在本實驗流程中，Versette的使用可以完全替代864次的人工移液，最大程度減小人工操作誤差，提升了方法的精確性，并降低了實驗室人員的工作強度。

同時，應用Transcend TLX-2樣品前處理系統和五氟苯基固相分析柱，本方法能夠成功解析3-epi-25OHD3，避免了常規LC-MS/MS方法分析時對25OHD3的干擾，并且不降低色譜的通量。

同樣的自動化液體處理和自動化在線樣品前處理實驗流程可應用于分析其他化合物，包括質譜免疫分析流程(MSIA)測定PTH和維生素D結合蛋白。

圖1.25-羥基D2/D3結構示意圖。

圖2. 液體處理程序圖。

圖3.Cryobank凍存管。

圖4. 8通道手持式旋蓋封口機/啟蓋器。

圖5.Versette 自動移液工作站及DARTs吸頭。

圖6.Transcend在線凈化系統和 TSQ Vantage 質譜儀。

表1：不同液體處理步驟所需耗材配件列表

圖7：樣品404和405色譜圖。3-epi-25OHD3 可以與 25OHD3 相區分。樣品405為在樣品404中加入3-epi-25OHD3所得。