用了這款萬能酶，苯甲醇綠色合成不是事兒

 該研究獲選為ACS Catalysis封面文章。受訪者供圖

化妝品、藥品、化學品等工業制備中有一種重要的中間體，就是苯甲醇。傳統上用化學法生成苯甲醇的工藝過程繁瑣，且會生成大量污染環境的副產物。

苯甲醇能否實現綠色高效生產？這一直是工業界和學術界共同關注的問題。

湖北大學生命科學學院、省部共建生物催化與酶工程國家重點實驗室教授李愛濤、陳純琪和郭瑞庭團隊合作，成功解決了這一難題。他們首次解析了萬能酶——細胞色素P450tol及其復合體晶體結構，并基于此構建了一種活性和穩定性均明顯提升的人工融合酶，實現了苯甲醇的高效綠色合成。

北京時間2月14日，相關研究成果在線發表于《美國化學學會會刊—·催化》（ACS Catalysis），并被選為封面文章。

萬能酶P450的神奇定向進化

論文通訊作者李愛濤告訴《中國科學報》，苯甲醇工業生產采取兩步法，以甲苯為原料，需要用到劇毒的氯氣和強堿氫氧化鈉，才能實現甲苯中惰性C?H鍵的官能團化，制備出苯甲醇。

“C?H鍵具有較高的解離能，通常具有較高的熱力學穩定性和較低的化學反應性，因此，C?H鍵官能團化是傳統化學合成中一個極大的難題，被認為是有機化學中的一座‘圣杯’。”李愛濤說。

能不能找到一種辦法，將甲苯綠色高效地轉化為苯甲醇呢？

李愛濤和他的團隊想到了酶這種地球上生命中最強大的化學工具。通過理性設計和定向進化手段，酶展現出了在生物催化領域的強大功能。

其中，細胞色素P450酶能夠識別多種參與生化反應的物質（即底物），利用基因工程改造P450酶來量身定制化學反應，成為一個熱門研究方向。2018年諾貝爾化學獎得主阿諾德教授，就是利用P450酶的定向進化實現了各種特殊的化學反應而獲獎。

在前期研究中，李愛濤從甲苯降解菌中鑒定了一種特殊的P450酶，命名為P450tol。它以甲苯為底物，生成專一的產物苯甲醇。這是迄今發現的唯一可以天然催化甲苯生成苯甲醇的酶。

然而，P450tol三維結構信息的缺乏，限制了針對P450tol的基礎研究與未來的應用。

揭開特殊P450酶的神秘面紗

要改造高效的P450tol，必須揭開酶結構的面紗。

2020年5月，郭瑞庭團隊在世界上首次解析了一種自給自足P450酶的全長晶體結構，獲得了廣泛的關注。

為此，李愛濤團隊和郭瑞庭團隊展開了合作。“我們非常高興能與李愛濤合作。”郭瑞庭說，這次合作解開了P450tol的結構謎團。

在這項研究中，郭瑞庭、陳純琪團隊順利解析了P450tol的空結構以及與底物甲苯及產物苯甲醇的復合體結構。通過這些結構信息，精準的揭示了P450tol由甲苯通過一步反應生成苯甲醇且沒有副產物生成的酶結構與催化機制。

陳純琪告訴《中國科學報》，P450酶的活性區都會帶一個血紅素分子參與催化反應，這次解析的P450tol也不例外。底物甲苯位于由一系列疏水的氨基酸組成的口袋中，甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子，兩個氨基酸（F329和A279）分別位于底物的兩側，牢牢鉗住了甲苯的苯環，甲苯前方還有一個氨基酸（V326）負責固定整個甲苯的位置。

“這樣，催化反應發生時就可以精確的發生在芐基位，而不是其它任意的位置，如此精巧的反應也只有酶可以做到了。”陳純琪說。

他們在P450tol與苯甲醇的復合體結構中看到了類似的現象，只不過苯甲醇的羥基代替甲苯的甲基朝向血紅素中心的鐵離子。

“我們還觀察到了一個非常有意思的現象，甲苯或苯甲醇并不能將P450tol的活性區完全占據，還有一些多余的空間，所以我們猜測P450tol或許可以結合比甲苯或苯甲醇更大一些的底物。”陳純琪說。

進一步實驗結果與他們推測的一致，P450tol也可以與一些鹵代甲苯形成復合體，且可以精確的在芐基位發生羥基化反應。

所有這些結果都顯示，底物會以有利于反應發生的方式結合并參與反應，這也使酶的反應更精準而高效。

人工融合酶催化苯甲醇綠色合成

李愛濤告訴記者，自然界中大部分的P450酶都需要一個能夠與之匹配的還原酶來提供電子以發生催化反應，這對于后續的應用是一個難題。

為了實現工業應用，尋找天然的自給自足型P450酶或者索性構建高效的自給自足型P450人工融合酶成為科研工作者關注的焦點。

“2020年5月郭瑞庭團隊解析的自給自足型P450酶（CYP116B46）的全長晶體結構，給我們構建自給自足型人工融合酶帶來了非常大的啟發。”李愛濤說，他們將P450tol和CYP116B46的還原酶結構域融合，構建出一個新的自給自足型人工融合酶。

新的酶不論在酶活性、穩定性，還是半衰期方面都獲得了很大的提升，且兩種融合酶具有相似的底物親和力。

“目前，P450tol和CYP116B46的融合是世界上首例報道的穩定性和活性均大幅提升的人工融合酶，有很大的希望應用于實際的工業生產中。”李愛濤說，最近已經有企業向他們伸出了橄欖枝，表示對該項技術很感興趣，有意向進行下一步研發或中試。

“不僅如此，P450tol-CYP116B46還可以催化丙基苯，形成羥基化產物，其中有些是非常重要的藥物中間體。”李愛濤說，基于P450tol的三維結構，他們使用蛋白質工程的手段理性設計和改造，使其反應更多的朝向對人類有益的方向發生。

在論文投稿過程中，審稿的三位審稿人指出原來的苯甲醇生產，是利用高污染、多副產物的化學合成法來完成的，審稿意見中都非常贊同本文利用酶的生物催化來準確的生成苯甲醇這些的重要化學品。另外，原來的這個酶要能夠催化酶反應，還需要和另一個與之匹配的還原酶來提供電子以進行反應，作者們在本篇文章中，構建了非常穩定的人工融合酶，對于應用到未來的綠色生物催化生產制程中，具有非常大的潛力。

“在未來的研究領域，隨著結構生物學、人工智能、酶定向進化等的大力發展，通過理性設計和改造，獲得更多新的具有重要功能的酶來造福于人類，將會是一個重要的研究和發展方向，我們也將繼續致力于更多P450tol人工融合酶的構建，期待獲得更具挑戰的新反應和性能獲得極大提升的新酶。”郭瑞庭說。