生物芯片概述

實驗概要

         生物芯片這一名詞最早是在80年代初提出的，主要指分子電子器件。美國海軍實驗室研究員Carter  等試圖把有機功能分子或生物活性分子進行組裝，想構建微功能單元，實現信息的獲取、貯存、處理和傳輸等功能。用以研制仿生信息處理系統和生物計算機。產生了"分子電子學"同時取得了一些重要進展：如分子開關、分子貯存器、分子導線和分子神經元等分子器件，更引起科學界關注的是建立了基于DNA或蛋白質等分子計算的實驗室模型。進入90年代，另一類"生物芯片"引起了人們的關注，通過機器人自動打印或光引導化學合成技術在硅片、玻璃、凝膠或尼龍膜上制造的生物分子微陣列。實現對化合物、蛋白質、核酸、細胞或其它生物組分準確、快速、大信息量的篩選或檢測。

實驗步驟

 一、分類

    根據分子間特異性相互作用的原理，將生命科學領域中不連續的分析過程集成了芯片表面，構建微流體(Microfluidics)生物化學分析系統。按照芯片上固定的生物分子的不同，可以將生物芯片劃分為：基因芯片、DAN芯片、蛋白質芯片及芯片實驗室(Lab-on-chip)。從其功能不同的角度，又可分為：測序芯片、表達芯片和比較基因組雜交(CGH)芯片。

二、制備

    1. 載體材料的要求：作為載體必須是固體片狀或者膜、表面帶有活性基因，以便于連接并有效固定各種生物分子。

    2. 載體種類：玻璃片、PVDF膜、聚丙烯酰氨凝膠、聚苯乙烯微珠、磁性微珠。

    3. 芯片制備方法：兩大類：一類是原位合成；一類是預合成后點樣。

       原位合成：適用于寡核苷酸，通過光引導蝕刻技術。已有P53、P450，BRCAI/BRCA2 等基因突變的基因芯片。

       預合成后點樣：是將提取或合成好的多肽、蛋白、寡核苷酸、cDNA、基因組DAN等 通過特定的高速點樣機器人直接點在芯片上。由于該技術
               相對簡易低 廉，被國內外廣泛使用，目前市場上銷售的芯片大多采用這一技術制作的。

       接觸式點樣：是指打印針從多孔板取出樣品后直接打印在芯片上。打印時針頭與芯片接觸。優點是探針密度高，通常一平方厘米可打印2500個
                探針。 缺點是定量準確性及重現性不太好。

       非接觸式點樣：針頭與芯片保持一定距離。優點是定量準確重現性好，缺點是噴印的斑點大，密度低。通常一平方厘米只有400點。但是日本  
                 佳能公司 能把噴印點直徑大小由150-100μm降到30-25μm。可將哺乳動物整個基因組DNA點陣于一張芯片上成為可能。    

    4. 生物樣品的制備：分離純化、壙增、獲取其中的蛋白質或DNA、RNA并用熒光標記，   才能與芯片進行反應。 用DNA芯片做表達譜研究時，通常是將樣品先抽提mRNA，然      后 反轉錄成cDNA。同時摻入帶熒光標記的dCTP或dUTP。

三、檢測設備

        以基因芯片為例：基因芯片的原型是80年代中期提出的，興起于90年代后期。基因芯片的測序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，可以用圖來說明。在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當溶液中帶有熒光標記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應位置的核酸探針產生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據此可重組出靶核酸的序列。

      雜交反應是熒光標記的樣品與芯片上固定的探針間進行特異性選擇反應的過程。芯片雜交屬于固一液相雜交。芯片雜交結果的檢測要依據標記的報告分子的種類來選擇不同的檢測設備。

     早期使用的同位素標記法，需經過暴光、顯影，再用特殊的掃描儀掃讀。目前最常見最成功的標記法是熒光標記，雜交反應后各個反應點上的熒光位置。熒光強弱經過芯片掃描儀和相關軟件進行分析，將熒光信號轉換成數據。即可獲得有關生物信息。

    1. 質譜分析技術：應用于蛋白質芯片結果的分析，不僅能檢測到和芯片上蛋白質發生相互作用的靶蛋白，并且能同時測算出靶蛋白的分子量甚至結構。

    2. CCD檢測：（Charge coupled device）：應用于基因芯片和DNA芯片。分辨率低，一般30-50μm。

    3.  激光掃描共聚焦：（Laser Scanning Confocal Imaging  System）：應用于基因芯片和DNA芯片。基因芯片微陣列的點非常微小，利用激光共聚焦原理可以讓光路直接聚焦到樣品點表面，有效防止雜質信號產生的背景噪音干擾。包括：灰塵熒光，樣本背面的污染，固相基質如玻璃的熒光信號和來自掃描儀光學組件熒光污染。

     共聚焦：是指光（激發和發射）在兩個位置上聚焦。

             激發光聚焦在樣本上。

             發射光聚焦在針孔上。這一針孔限制儀器在樣本表面的聚焦深度從而降 低背景信號的強度。

      激光共聚焦的分辨率可高達5μm，并可以根據實驗需要選擇不同的分辨水平5μm，10μm，20μm，30μm，50μm。

        微陣列點的直徑范圍通常在25μm到50μm，大多在100μm左右。對100μm的點進行精確的分析就要求檢測系統能夠將每個微陣列點分割成盡可能多的像素。有意義的像素越多，在進行熒光信號的定量分析時每個點的邊緣就可以分析的越準確，就越可以與其它非特異性的信號區分開。一般來說，像素大小或空間分辨率不應大于最小的微陣列點直徑的1/8~1/10（例如10μm分辨率檢測100μm微陣列點。）

四、生物芯片的應用

     1. 基因差異表達分析 表達芯片主要是采用DNA芯片分析兩組來源不同的mRNA轉錄豐度的差異，是生物芯片技術最常見最廣泛的應用。DNA微陣列和寡核苷酸基因芯片兩種不同芯片模式在基因表達譜分析具體實驗方法上還有差異。

     采用DNA微陣列模式，兩組mRNA樣本分別反轉錄成cDNA并分別摻入可分辨的不同熒光素標記（如Cy3和Cy5），二者同比例混合并同時和DNA微陣列雜交。

       采用寡核苷酸基因芯片模式，兩組cDNA樣本帶上同種熒光素標記，但分別和芯片單獨雜交再進行比較。二者都要通過計算兩組樣本雜交信號的比值（Ratio）并通過設立域值（Threshold）來確定已知基因在不同來源樣本中表達的差異或尋找不同樣本間差異表達的基因甚至是新基因。

      2. DNA測序、基因突變及多態性掃描  測序芯片是出現最早的生物芯片。通常SBH采用8聚（Hyseq）或者20聚（Affymetrix）寡核苷酸微陣列，與待測樣品進行雜交，根據雜交結果可推算出樣品DNA序列全長。基于此，寡核苷酸芯片也被用于基因突變及多態性掃描。

      3. 基因組DNA突變及染色體變異檢測  許多疾病是和染色體的缺失、重復、移位等變異有關。比較基因組雜交（CGH）是檢測染色體或基因組DNA水平發生變異的有效方法，但是存在分辨率低、難于進行特異性基因的定位及需要制備中期染色體等缺點。為克服這些缺點，Solinas-Toldo  S等推出一種名為"微陣列CGH"的新技術，無需制備中期染色體，熒光標記的基因組DNA與NA與微陣列上的明確DNA序列雜交。

     4. 腫瘤的發生機理、腫瘤分型和診斷  DNA微陣列被廣泛用于檢測腫瘤細胞和正常細胞在mRNA水平的差異，這不僅為腫瘤的診斷提供手段，而且為腫瘤發生機理的研究提供強有力工具。隨著DNA芯片技術的不斷成熟，腫瘤發生機理研究、腫瘤分型和診斷技術的發展將會大大加強癌癥治療的特異性和有效性。并可解決臨床上腫瘤治療中存在副作用大等問題。

      5. 傳染病診斷  目前國際國內對于傳染病診斷芯片的研制投入了大量人力物力，方法也是各不相同，有的用DNA芯片，有的用蛋白質芯片。DNA芯片是將許多特定的寡聚核苷酸或DNA片段固定在芯片的預設區域內，以檢測對應片段是否存在、存在量多少。蛋白質芯片則是期望將傳統的ELISA診斷方法縮微化，把不同傳染病的抗原或抗體點陣于芯片上不同區域，再與病人血清進行免疫反應，以檢測血清中因感染外部傳染源發生免疫應答而產生的自身免疫抗體及外來病原體。

      6. 環境保護和監測  在環境監測和環境保護上，可以利用生物芯片快速檢測污染微生物或有機化合物對環境、人體、動植物的污染和危害。我們都知道，環境的變化會引起細胞發生基因表達譜模型的變化，DNA芯片是高效的監測基因表達譜變化的手段。所以，國外許多實驗室紛紛探索用DNA微陣列技術監測環境污染和提高環境保護技術水平。生物芯片在環境保護方面的應用還可以通過大規模的篩選尋找保護基因，制備防治危害的基因工程藥品及能夠治理污染源的基因產品。

    7. 生物芯片的其它應用除上述應用外，生物芯片技術還廣泛應用于基因組文庫作圖、疾病預測、藥物篩選、衰老和發育過程研究等等。另外生物芯片在農業、食品監督、商品檢驗、司法鑒定及軍事等方面都將作出重大貢獻。

       如上所述，生物芯片已經并將繼續被廣泛應用于生命科學研究及實踐領域。但是我們也該清醒地意識到，生物芯片技術還有許多問題亟待解決，如提高芯片的特異性、簡化樣品制備和標記操作程序、增加信號檢測的靈敏度等等。另外，生物芯片如欲獲更大發展空間，尤其是如果想進入臨床檢驗診斷市場，以下各方面是急需解決的問題。

    （1）、生物芯片的重復利用。現在的生物芯片都是一次性使用的易耗品，價格非常昂貴。這就要求生產廠商要么生產出可重復利用的生物芯片，要么降低芯片一次性消耗的成本。

    （2）、生物芯片的多重用途。現在的芯片基本都是單一用途，不象微電子芯片能通過程序控制發揮多重用途。

    （3）、統一的行業標準。醫學檢驗都必須經過嚴格審查，檢驗結論都必須具有科學的解釋，而且是建立在標準化基礎之上。生物芯片如欲推向臨床診斷市場，必須建立統一的行業標準。

    （4）、定量分析。如DNA芯片檢驗結果不僅要告知某特異性DNA是否存在于待測DNA樣品中，還應該告知該特異性DNA在待測樣品中的含量。