（一）生物學技術—RT-PCR技術— 組織或細胞樣本
不是每種組織或細胞都表達所有的基因，即某些基因的mRNA不存在于某些組織或細胞中。因此，確定所選用的材料中是否含有需擴增的目標mRNA模板是實驗成敗的關鍵。
（二）生物學技術—RT-PCR技術— 引物
合成cDNA第一條鏈時，引物可用隨機6聚核苷酸，或下游引物，或poly（dT），其中以6聚核苷酸的隨機引物效果最好。
（三）生物學技術—RT-PCR技術— 反轉錄酶
不同來源的反轉錄酶均可較好地用于第一鏈cDNA的合成，其合成受不同RNA模板的影響。提高反轉錄溫度（55℃）、增加1～3倍的酶量可克服RNA二級結構的影響。
（四）生物學技術—RT-PCR技術— cDNA反應產物
合成eDNA第一鏈所用的RNA模板不影響PCR反應，無需用堿或RNase處理去除。另外，沒有必要將cDNA反應產物全部用于PCR，用其1/25～1/10即可。
（五）生物學技術—RT-PCR技術— RNA酶污染
避免RNA酶污染是RT—PCR成功的關鍵之一。用于RNA操作的各種器皿，包括Eppen—dorf管、Tip頭等，都應該用RNA酶抑制劑處理，試劑應該用RNase—free水配制。使用的全部器皿和耐高壓的試劑都必須經高壓滅菌處理。在操作全過程中，操作者都應該戴一次性手套和口罩，以防污染。