瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

目的：

學習水平式瓊脂糖凝膠電泳，檢測質粒DNA的構型、分子量的大小。

原理：

瓊脂糖是從海藻中提取出來的一種線狀高聚物，可作為電泳支持物，適用于分離大小范圍在0.2～50kb的DNA片段。DNA分子的遷移率與分子量的對數值成反比關系。觀察其遷移距離，與標準DNA片段進行對照，就可獲知該樣品分子量大小。在質粒抽提過程中，由于各種因素的影響，使質粒DNA呈現超螺旋的共價閉合環狀、開環狀分子、線狀分子三種不同的構型，這三種分子有不同的遷移率。在一般情況下，超螺旋型遷移速度最快，其次為線狀分子，最慢的為開環狀分子。用熒光染料溴化乙錠（ethidium bromide，EB）進行檢測，溴化乙錠嵌入堿基對之間形成熒光絡合物，在紫外線激發下發出紅色熒光。

儀器與主要試劑：

儀器：

1) 電泳儀
　　2) 水平電泳槽
　　3) 紫外檢測儀

主要試劑：

1) 提取的質粒DNA
　　2) 5×TBE：54gTris；27.5g硼酸；EDTA （0.5mol/L，pH 8.0）20ml，加水至1L，用前稀釋10倍
　　3) 溴化乙錠（EB）：10mg/ml溶液
　　4) 溴酚藍

實驗方法：

1) 稱取1g瓊脂糖于100ml 0.5×TBE中，加熱溶解，冷卻至65℃左右再加入終濃度為0.5%～1.0%的EB。

2) 電泳膠模兩端用透明膠帶封固，梳子至于適當位置，將冷卻至65℃左右的瓊脂糖溶液慢慢倒在膠模上，厚度約3mm。靜置，待膠凝固后揭去膠模兩端的透明膠帶，放入電泳槽內，倒入適量電泳緩沖液（一般液面高出凝膠1cm），小心拔出梳子。

3) 將5μg提取的質粒DNA樣品，與等體積溴酚藍指示劑混勻，加入凝膠點樣孔內，防止產生氣泡和樣品溢出。

4) 將電泳槽通電，80V恒壓電泳30分鐘。

5) 電泳完畢，關掉電泳儀，倒去電泳槽中的電泳緩沖液，小心取出凝膠置于紫外燈下觀察結果，質粒DNA條帶發出紅色熒光。

注意事項：

1) 防止紫外線對人皮膚及眼睛的損傷，避免直接照射皮膚與眼睛。

2) EB是強誘變劑，有致癌性，操作時要帶手套，防止污染。所有含有EB的溶液在棄置前應當進行凈化處理。