用胰蛋白酶消化單層細胞或分散原有組織，將細胞接種到涂布瓊脂的底物上。將聚集物轉移到 24 孔培養板，進行分析。
| 實驗方法原理 | 用胰蛋白酶消化單層細胞或分散原有組織，將細胞接種到涂布瓊脂的底物上。將聚集物轉移到 24 孔培養板，進行分析。 |
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| 實驗材料 | 諾貝爾瓊脂0.25%胰蛋白 |
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| 試劑、試劑盒 | 生長培養液超純水 |
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| 儀器、耗材 | 培養瓶24孔培養板Petri培養皿 |
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| 實驗步驟 | 一、用球脂涂布 25 cm2 培養瓶
1. 將 1 g 諾貝爾瓊脂加入 100 ml 帶有松螺旋蓋的硼硅酸鹽玻璃瓶中，瓶內裝有 20 ml UPW。
2. 在 100℃水浴中將瓊脂加熱 10 min，或直至瓊脂完全溶解。
3. 立即將瓶中的內容物加入預熱至 37℃ 的 60 ml 生長培養液中，然后分別按 5 ml 量加入每個培養瓶中。保證瓊脂內無氣泡。
4. 將瓊脂在室溫條件放置約 5 min，以準備 1.25% 瓊脂包被的培養瓶。
二、用瓊脂涂布多孔培養板
1. 將 0.5 g 瓊脂加入到 10 ml UPW 中，如涂布 25 cm2 培養瓶的步驟 2 加熱，然后加入 40 ml UPW。
2. 在 24 孔板的每個孔內加入 0.5 ml 終溶液，準備 1% 瓊脂涂布的培養孔。精確和小心地加入是很重要的，以保證在隨后球體的觀察中很容易對各個孔進行顯微鏡聚焦。
三、球體形成
1. 對于已建立的細胞系，用胰蛋白酶消化匯合的單層細胞，或者使間體腫瘤細胞分散，以產生單細胞懸液。
2. 如果需要，可用含血清的培養液中和胰蛋白酶。
3. 用電子細胞計數器或血細胞計數板對細胞進行計數。
4. 在每個瓊脂預涂的 25 cm2 培養瓶中加入 5 ml 含 5x105 個細胞的生長培養液，然后培養細胞。如果細胞具有球體形成的能力，3~5 d 內可自發形成聚集的小簇（直徑約為 100~300 um）。
為了便于以后的生長，應當將球體移入新的 25 cm2 培養瓶或 24 孔培養板。
四、轉移到 25 cm2 培養瓶
1. 將原培養瓶中的培養物移入錐形離心管或普通容器中。
2. 讓球體沉降后，取出上清和單個的細胞。
3. 用新鮮培養液將球體再懸浮，然后將懸液移入新的瓊脂預涂的培養瓶。球體可在這些培養瓶中通過外層細胞的分裂繼續生長。
五、轉移到 24 孔培養板
1. 將每個 25 cm2 培養瓶中的培養物移入 6 cm Petri 培養皿。
2. 在 24 孔板的每個瓊脂預涂的孔中，加入 0.5 ml 培養液。
3. 在低倍鏡（40x）下，逐個地選擇一定大小的球體。用 Pasteur 吸管和 Pipump 或借助具有適當微調的其他移液器，將選定的類似直徑的球體逐個移入瓊脂預涂的 24 孔培養板的每個孔中。
4. 將 24 孔培養板放入 CO2 培養箱。
5. 每周更換培養液 1 或 2 次，每次換液 0.5 ml。或每周 1 或 2 次加入培養液 0.5 ml (沒有移出任何培養液），2~4 周后培養液達到 2 ml/孔。 展開 |
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| 注意事項 | 涂布瓊脂時，所有的培養瓶、培養板和培養皿都應是無菌的，但不需要達到組織培養級。 |
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