特異性位點的DNA甲基化的檢測方法

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1 甲基化敏感性限制性內切酶 (methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE)-PCR/Southern法

這種方法利用甲基化敏感性限制性內切酶 對甲基化區的不切割的特性，將DNA消化為不同大小的片段后再進行分析。常使用的甲基化敏感的限制性內切酶有HpaⅡ-MspⅠ(識別序列CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。由于后者識別的堿基數相對較多，其堿基序列在體內出現的概率相對較低，所以以前者即HpaⅡ-MspⅠ更常用。其中HpaⅡ和MspⅠ均能識別CCGG序列，然而當序列中的胞嘧啶發生甲基化時，HpaⅡ不切割，利用HpaⅡ-MspⅠ的這種屬性處理DNA，隨后進行Southern或PCR擴增分離產物，明確甲基化狀態]。這是一種經典的甲基化研究方法，其優點是：相對簡單,成本低廉，甲基化位點明確,實驗結果易解釋;缺點是：1.由于CG不僅僅限于CCGG序列中，因此非該序列中的CG將被忽略;2.只有檢測與轉錄相關的關鍵性位點的甲基化狀態時,該檢測方法的結果才有意義;3.相對而言，Southern方法較復雜，且需要樣本的量大;4.存在著酶不完全消化引起的假陽性的問題;5.不適用于混合樣本。

2 直接測序法

直接測序 是由Frommer等提出的研究DNA甲基化方法過程是：重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增所需片段,則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶，最后,對PCR產物進行測序并且與未經處理的序列比較,判斷是否CpG位點發生甲基化。此方法是一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態，但需要大量的克隆測序,過程較為繁瑣、昂貴。

3 甲基化特異性的PCR (methylation-specific PCR, MS-PCR)

Herman等1996年在使用重亞硫酸鹽處理的基礎上新建的一種方法。它將DNA先用重亞硫酸鹽處理，這樣未甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶，而甲基化的不變，隨后行引物特異性的PCR。MS-PCR中設計兩對引物，并要求：1.引物末端均設計至檢測位點結束;2.兩對引物分別只能與重亞硫酸鹽處理后的序列互補配對，即一對結合處理后的甲基化DNA鏈，另一對結合處理后的非甲基化DNA鏈。檢測MSP擴增產物，如果用針對處理后甲基化DNA鏈的引物能擴增出片段，則說明該被檢測的位點存在甲基化;若用針對處理后的非甲基化DNA鏈的引物擴增出片段，則說明被檢測的位點不存在甲基化 。 DNA經重亞硫酸鹽處理后，以處理后的產物作為模板，加入甲基化特異性的引物(primerⅠ)或非甲基化的引物(primerⅡ)，進行特異性的擴增，只有結合完全的甲基化或非甲基化特異性引物的片段才能擴增出產物。這種方法的優點是：1.避免了使用限制性內切酶及其后續相關問題;2.敏感性高;可用于石蠟包埋樣本;缺點是：1.要預先知道待測片段DNA的序列;2.引物設計至關重要;3.若待測DNA中5-甲基胞嘧啶分布極不均衡，則檢測時較為復雜;4.這種方法只能作定性研究，即只能明確是否存在甲基化;若要求定量，則需用其他的方法進行進一步檢測;5.存在重亞硫酸鹽處理不完全導致的假陽性。

4 甲基化敏感性單核苷酸引物延伸(methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE)

Gonzalgo and Jones 1997年提出了結合重亞硫酸鹽處理和單核苷酸引物延伸(Kuppuswamy等1991年提出)的Ms-SnuPE方法，用于定量檢測已知序列中特異位點的甲基化水平。過程是：先將研究序列用重亞硫酸鹽處理，未甲基化的胞嘧啶全部轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。進行PCR擴增，然后取等量擴增產物置于2管中，分別作為Ms-SnuPE單核苷酸引物延伸的模板。設計用于Ms-SnuPE延伸的引物的3’端緊鄰待測堿基。同時于2個反應體系中加入等量的Taq酶、引物、同位素標記的dCTP或dTTP。這樣，如果待測位點被甲基化，則同位素標記的dCTP會在反應延伸時連于引物末端;若是未被甲基化，則標記的dTTP參與反應。末端延伸產物經電泳分離和放射活性測定后可得出C/T值，即為甲基化與非甲基化的比值，從而分析得到待測片段中CpG位點甲基化情況。同理也可以用dGTP或dATP。而且，若需研究一條鏈上不同位點CpG甲基化情況，可通過設計不同的引物在同一反應中完成。 DNA經重亞硫酸鹽處理后，以PCR擴增后得到產物作為Ms-SnuPE延伸的模板，于反應體系中入設計好的引物和同位素標記的dCTP或dTTP進行甲基化特異的單核苷酸引物延伸，隨后，電泳分離、測定同位素放射活性，確定甲基化水平。這種方法的優點：1.可以了解特異位點甲基化情況且不受內切酶的限制;2.通過設計的不同引物在同一延伸反應情況可以了解不同位點CpG甲基化的狀況;3.可以檢測出樣本序列中分布不均勻的甲基化位點;4.是一種能夠用于定量檢測甲基化水平的方法;5.僅需少量的DNA樣本，可以用于石蠟包埋樣本的測定。缺點是：1.實驗步驟略復雜，若要檢測多個位點時則需設計多個引物;2.存在放射性污染及重亞硫酸鹽處理不完全的問題。

5 結合重亞硫酸鹽的限制性內切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)

Xiong and Peter報道了COBRA[31]甲基化檢測法。這種方法對標本DNA行重亞硫酸鹽處理及PCR擴增，處理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶變為胸腺嘧啶。隨后用限制性內切酶對轉化后PCR產物切割的特性以識別原標本DNA的甲基化狀況。重亞硫酸鹽處理DNA后行PCR擴增，用限制性內切酶(BstUI)識別轉化后序列中的酶切位點，消化產物電泳分離，與完全非甲基化陰性對照組比較，得出序列中特異位點甲基化水平。

6 甲基化敏感性單鏈構象分析(methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA)

甲基化敏感性單鏈構象分析(MS-SSCA)又稱重亞硫酸鹽甲基化-PCR-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)(BiPS)，由Maekawa等1999年[32]報道。方法是：先用重亞硫酸鹽處理待測片段，針對非CG二核苷酸區設計引物進行PCR擴增，擴增產物變性后作非變性的聚丙酰胺凝膠電泳，由于DNA電泳時的移動性取決于其二級結構即DNA的空間構象，而后者又由DNA堿基的序列決定。因此，經處理后變性的單鏈DNA將停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，這樣甲基化與非甲基化的就被分離開，隨后行單鏈構象多態性分析加以明確： 重亞硫酸鹽處理DNA后，設計引物(非CG二核苷酸區)對處理后的DNA進行擴增, 產物解鏈后行聚丙酰胺凝膠電泳，由于甲基化和非甲基化單鏈DNA形成不同的空間構象，它們在電泳中移動速率不同， 故出現在不同位置，從而判定待測片段中甲基化情況。這種方法的優點是：1.能夠方便的應用于任何序列的甲基化狀態分析;2.能夠對甲基化的等位基因進行半定量;3.可以提示甲基化狀態分布的不均勻性;缺點是：1.只有甲基化水平較高的單鏈才能明顯的區分開，而較低水平的則不易分開，有時會因甲基化的CpG位點隨機和不均勻分布導致電泳條帶出現擁擠、拖尾的現象，故敏感性及準確性略低;2.檢測片段不宜過長。

7 甲基化敏感性變性梯度凝膠電泳(methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis，MS-DGGE)

變性梯度凝膠電泳(DGGE)是一種能夠將具有單堿基差別的DNA分離的方法。其原理是：當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性溫度對應一致的位置時，DNA部分解鏈(解鏈區域的長度大小不等)，與每一個解鏈區域相對應的溫度稱為解鏈溫度(T)。Tm主要由核苷酸的序列決定，這是因為DNA鏈上相鄰堿基間的相互作用對穩定DNA雙螺旋起重要作用。因此，很小的變化(如單堿基變化)也會引起DN***段Tm值的改變。DGGE系統中，DN***段在變性梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳時，由于凝膠中變性劑濃度自上而下呈梯度遞增，因此，當DN***段到達與該區域的T值相當的某一濃度位置時，DNA解鏈變為分枝狀，其移動減慢，停留在凝膠的的某一位置，這樣不同的DN***段就被分離。mAggerholm等1999年將其用于甲基化的檢測，先用重亞硫酸鹽處理DNA使為甲基化的胞嘧啶轉變為尿嘧啶引起點突變，這樣再結合使用DGGE，經電泳分離、分析該片段的甲基化狀況。這種方法的優點是：DGGE可以用來檢測出除最高溫度解鏈區域以外的所有發生甲基化的DN***段，需樣品量少，能較直觀的顯示出甲基化情況。缺點是：解鏈溫度和DGGE的變性濃度梯度需要摸索。

這種方法的優點有：

1.方法相對簡單，不需預先知道CpG位點及樣本序列;

2.可以進行甲基化水平的定量研究;

3.需要樣本量少，可用于石蠟包埋樣本的分析。

缺點是：1.只能獲得特殊酶切位點甲基化情況，因此檢測陰性不能排除樣品DNA中存在甲基化的可能;2.由于酶和PCR的使用，只能分析一種特定序列。

8 甲基化敏感性解鏈曲線分析(methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA)

Worm等2001年報道的MS-MCA是將DNA經重亞硫酸鹽處理與Lightcycle聯用檢測DNA序列甲基化的方法。熒光素標記雙鏈DNA。這種方法根據檢測到的熒光度對應的解鏈溫度，判斷分析研究序列中甲基化的情況。在Lightcycle過程中，隨著溫度升高，逐漸達到DNA雙鏈各解鏈區域的解鏈溫度Tm，DNA呈區域性逐漸解鏈，一般說來，序列中CG含量越高，對應的解鏈溫度越高。由于非甲基化的胞嘧啶經重亞硫酸鹽處理后變為尿嘧啶、PCR后變為胸腺嘧啶，故其所在序列中的CG含量降低，熱穩定性降低，解鏈溫度降低。而甲基化的由于其CG含量高，故其解鏈溫度高。所作結果與標準曲線對照，根據這種特性就可以明確研究序列中CpG的分布區及甲基化程度。 這是一種能對甲基化分布不均勻的DNA樣本進行半定量分析的方法。缺點是：1. 它不能夠精確檢測甲基化的具體位點;2.研究序列的長度不宜過長;3. 該法對低水平的DNA甲基化敏感性低[37]。

9 熒光法(Methylight)

Eads等2000年報道的熒光法利用實時PCR(Real-time PCR)測定特定位點甲基化的情況。其過程如下：先用重亞硫酸鹽處理待測DN***段。設計一個能與待測位點區互補的探針，探針的5'端連接報告熒光，3'端連接淬滅熒光，隨后行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，這樣報告熒光發光，測定每個循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平;同理，若標記的探針未能與DNA雜交，則引物延伸不能跳過未甲基化位點，報告熒光不被切下，不發光。同樣方法，也可對引物進行熒光標記，并通過不同標記的組合，檢測多個位點的甲基化水平。高敏感、快速是本方法最顯著的特點,它可以在非甲基化等位基因超出10000倍的情況下精確的檢測到甲基化的等位基因并定量，而且可以做多樣本、多基因位點的快速分析。此外其具備可重復、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點。它可以為臨床標本的分子生物學研究提供可靠的技術支持。缺點是費用高，測定每個位點都要用兩端標有熒光素的探針和一對引物，且受較多因素影響。

10 DNA微陣列法

Yan等2001年將以分子雜交為基礎的微陣列技術應用于DNA甲基化檢測中，這種方法是基于雜交的寡核苷酸微陣列，是一種在基因組中尋找新位點的方法。包括用于整個基因組范圍內掃描的差異甲基化(DMH)雜交(Huang等1999年)和用于檢測某個位點的甲基化特異性微陣列MSO(Gitan等2002年)。前者類似于mRNA表達譜或cDNA微陣列，是CpG島微陣列，后者類似于寡核苷酸微陣列，是針對CpG二核苷酸位點的甲基化特異性寡核苷酸微陣列。 MSO要求預先設計一對含有2個不相鄰的GC(或AC)的探針，用于識別甲基化和非甲基化的序列，其中含GC的探針(5[42]'---GC---GC---3')識別甲基化序列，含AC的探針(5'---AC---AC---3')識別非甲基化序列，探針的5'端通過Linker固定于玻璃板上。首先對待研究片段用重亞硫酸鹽處理，將非甲基化的胞嘧啶變為尿嘧啶，甲基化的不變，再行PCR擴增，產物的3'端用熒光素標記，移至連有探針的玻璃板上進行雜交，通過檢測雜交后產生的熒光強度判斷待測序列中甲基化的水平。此方法一定要設立對照。該法可用于多樣本、多位點甲基化的檢測，樣本需要量少，適于臨床樣本，但存在假陽性問題。

11 甲基化敏感性斑點分析(methylation sensitive dot blotassay，MS-DBA)

G Clément等2005年報道了一種新的方法，能夠定量或半定量分析樣本中的甲基化水平。這個方法的過程是：先用重亞硫酸鹽處理待測DN***段，隨后以非CG區的引物行PCR擴增，將擴增產物變性后轉移到尼龍膜上，用3'端DIG標記的含有2個CG(或TG)的雙核苷酸探針與DNA雜交，隨后用帶有熒光標記的抗DIG抗體與之反應。與雙CG的探針獲得雜交的標本含有甲基化，而與TG探針雜交的標本未被甲基化。通過比較斑點上熒光的強度測定甲基化水平。這種方法的優點是快速、簡便、易于掌握，可一次檢測多種樣本，包括石蠟包埋樣本。缺點是：1. 檢測序列不能過長;2. 若探針錯誤雜交或重亞硫酸鹽處理不完全，則可能出現假陽性或假陰性結果。

12 甲基化特異性多連接依賴性探針擴(Methylation-Specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA)

Anders O.H.等2005年改進MLPA為MS-MLPA用于檢測特異位點的甲基化。MS-MLPA中，針對甲基化的和非甲基化的位點分別設計兩個探針，每個探針都包括兩個寡核苷酸部分，其中短的部分由合成產生，長的部分來源于phageM13的衍生物，后者有一個非雜交填充片段，不同探針其長度不同。探針的兩個寡核苷酸雜交序列均與目標序列互補，其末端都連有相同的PCR引物。且要求設計的MS-MLPA的探針要有甲基化敏感的限制性內切酶HhaⅠ(GCGC)或HpaⅡ(CCGG)的識別位點,這樣，經探針和目標序列雜交后，降低反應體系溫度，并向其中加入連接酶HhaⅠ，若原樣本DNA中含有HhaⅠ識別的非甲基化的位點，則非甲基化探針的兩個寡核苷酸部分不能連接，而甲基化的探針順利連接不被切割，在隨后的PCR反應中只有兩個寡核苷酸部分連接后的探針才能被擴增。最后分析擴增片段，確定待研究位點的甲基化情況：用設計好的甲基化與非甲基化的探針(探針各寡核苷酸部分含有雜交序列，不同探針其填充片段的長短不同)分別與待測DNA雜交，結合上的寡核苷酸探針經連接酶連接，若DN***段中存在甲基化位點，則帶有(HhaⅠ)識別位點的探針不能被切割，同理，若為非甲基化，則DN***段被HhaⅠ切開，且探針不能被連接，這樣，在隨后的PCR擴增過程中，只有連接的探針能被擴增，最后對擴增的片段進行分析，得出原DNA中特異位點甲基化的情況 。這種方法的優點是：1.需要樣本的數量少，由于探針具有非常短的識別序列，因此MPLA可以用于局部降解的DNA，如從石蠟包埋的DNA樣本;2.可用于分析大量混合樣本。缺點是探針連接位點受限制性內切酶位點識別的限制，且要考慮到所用酶的反應適宜溫度。

13 甲基化敏感性高分辨率溶解曲線分析(methylation-sensitive high-resolution melting analysis)

HRM技術這是近幾年國內外興起的一項高新技術，基于此技術Tomasz K Wojdacz等開發了MS-HRM技術，基本原理同MS-MCA的方法，針對甲基化區域附近設計引物，將修飾后的DNA做PCR，再進行低溫到高溫的溶解的過程，參照標準曲線，即可對樣本做定性和定量的分析，如下圖所示。其優點：操作簡便、高靈敏度、高通量、成本低。缺點:對儀器的要求較高，需使用帶有HRM模塊的熒光定量PCR儀