機制說明
與所有在治療上非常重要的酶一樣，激酶不僅僅是化合物干預的單分子靶標。 在催化循環期間，激酶會結合蛋白質底物、ATP、中間物和產物（圖 2）。 這些不同形式的酶也可能存在于很多不同的構象中。 所以，化合物可能指向不同形式的酶且不同的生化檢驗可能偏向不同形式的酶。 ATP 的生理濃度約為 2 mM，這表示 ATP 能夠（通常非常有效地）與在 ATP 位點結合的化合物競爭。 因此，尋找可在 ATP 之前或之后結合的化合物（稱作非競爭性化合物）或僅在 ATP 之后結合的化合物（稱作抗競爭性化合物）對于激酶藥物研發而言都是非常有吸引力的途徑。 然而，很多歷史悠久的激酶抑制劑都以酶的 ATP 位點為靶標，且預計在與酶結合時會和 ATP 競爭。 其他化合物可能以變構位點為靶標，預計不會與 ATP 競爭。 表征化合物的作用機制可以確定 ATP 或蛋白質底物的存在，對試驗化合物親和力的影響是提高、降低還是沒有影響。 研究這種性質有助于了解分子水平的結構-活性關系 (SAR)，其同時也是尋找新型藥效的關鍵。
圖 2：假定的蛋白質激酶催化循環。 在這個簡化的示意圖中，酶在催化循環期間結合底物和產物，所以在磷酸轉移反應期間至少有四種酶形式。 這些不同的酶形式的每一種都將是動態的，且可以進入不同的構象，說明每種激酶可能代表化合物干預的多個不同靶標。 ITC 至少可以測量化合物與這些分離的酶形式中的一些形式的結合親和力，有利于理解抑制劑結構-活性關系 (SAR)。
酶動力學檢測法通常不是為了反應途徑上發生的特定的酶形式而設計。 因此關于最大親和力的相關酶形式的信息有時候很難直接獲得。 ITC 通過測量對不同的預設酶形式的結合親和力可以克服這個限制。 結合游離酶是最簡單的方法，但是根據催化機制可以安排ITC 條件以探測其他酶形式，例如酶-蛋白底物、酶-ATP、酶-ADP 或酶-磷酸化產物復合物。 非可水解 ATP 類似物的使用在探測結合酶與兩種底物的三元復合物的潛在化合物中也非常有用。
對某種蛋白激酶靶標進行了關于表征 ATP 對試驗化合物結合的影響的實驗。 對于一種試驗化合物在存在和不存在 100μM ATP 時使用 Malvern MicroCal? VP-ITC 進行 ITC滴定，對于 ATP 代表大約 60 × KD（圖 3）。
圖 3：非競爭性抑制劑結合。 在不存在（紅線）和存在（藍線）100 μM ATP 時試驗化合物對蛋白質激酶靶標的滴定。 在不存在 ATP 時的參數值為 KD = 0.19 μM，ΔH = -17.4 kcal/mol，n = 0.9，在存在 ATP 時參數值為 KD = 0.17 μM，ΔH = -9.4 kcal/mol，n = 1.1。