簡介
細胞因子是可溶性蛋白，在淋巴細胞應答中有重要的免疫調節作用。細胞因子可以調節細胞生長、分化以及一系列功能，并且介導正常與病理性免疫應答。細胞因子是具有效應及調節雙重作用的獨特蛋白。近來研究顯示，細胞因子可以具有多重功能，作用于多個細胞亞群并可在不同亞群細胞表達。
早期細胞因子表達與T細胞功能相關性研究是基于特定克隆細胞的激活。盡管研究應用T淋巴細胞克隆證明了不同細胞因子的合成，如TH1(IL－2，IFN－g)與TH2(IL－4，IL－5，IL－10)，但這些研究很難外推，因為T細胞克隆與體內T細胞功能相關性還未被揭示。
近來，Jung與Picker采用了Brefeldin(BFA)與monensin等藥物預孵檢測胞內細胞因子的表達的方法。這一方法阻斷了胞內高爾基體介導的轉運使得細胞因子聚集，蓄積，增強細胞因子信號可被流式細胞儀檢測。這一方法可檢測單個細胞內多個細胞因子，并可區分表達特定細胞因子的細胞亞群。使用特定刺激劑研究細胞因子應答是細胞因子研究中的重大進展。在細胞水平該方法證明了人與鼠的淋巴細胞都存在1型與2型分化，且這些分化在特定細胞因子增強時可被逆轉。且這些研究清楚地證明，只有激活的細胞亞群可以表達細胞因子，靜止的正常淋巴細胞(T、B、NK)不能分泌細胞因子。
胞內流式分析法基于目前BD的FastIMMUNE Cytokine System。抗細胞因子抗體與細胞表面或胞內特定亞群標志組合，即可檢測不同細胞亞群細胞因子的分泌。此分析采用特殊的化學與抗體選擇，確保靜止與無細胞因子分泌細胞的最小熒光背景。
檢測方法
圖一顯示了該方法主要步驟。
盡管方法簡單快速，免疫功能檢測要求激活過程與激活劑仔細制備、儲存與使用，因此該方法包括了BD研究組特殊推薦的激活步驟。成功地激活對得到可信的結果非常重要，因此在細胞收集與制備過程中必須排除可能干擾正常激活過程的因素。避免使用絡合鈣的抗凝劑ACD與EDTA，因為它會限制鈣依賴性激活過程，此外LPS，一種常見的生物試劑污染物，是強細胞激活劑，可能會混淆試驗結果。我們建議完全依照此方法，首先從正常血樣分析開始，再進行異常樣本的分析或更改試驗條件。
圖1、 FastIMMUNE胞內細胞因子檢測步驟
一、 儀器設備
1．12×75mm有蓋的Falcon管(BD Catalog No.2058)
2．37℃孵箱7%CO2
3．混勻振蕩器
4．離心機
5．加樣器、Tips
6．FACS流式細胞儀
二、 細胞
1、全血
使用肝素鈉抗凝的VACUTAINER真空采血管(BD VACUTAINER Catalog No.367673), FastIMMUNE不易采用肝素鋰，EDTA和ACD抗凝劑，血樣在8小時內分析，超過8小時會導致活性的損失，一般細胞因子陽性細胞會減少5%。如不能在8小時之內檢測，應將真空采血管水平室溫放置。
2、自身血漿中外周血單個核細胞(PBMCs)
使用肝素鈉抗凝的BD VACUTAINER 細胞制備管(CPTs)(BD VACUTAINER Catalog No.362753)24小時內分析。
3、組織培養基中的外周血單個核細胞(PBMCs)
用Ficoll分離PBMCs，調節細胞濃度2×106細胞/mL于含10%熱滅活胎牛血清(FBS)的RPMI－1640。
4、細胞系與T細胞克隆
調節細胞濃度2×106細胞/mL于新鮮培養基中。
5、冰凍全血與PBMCs
應用1×FACS溶血素，溶血固定激活全血或PBMCs用PBS漂洗，并用含1%的BSA及10%的DMSO的PBS，凍存－70℃。溶化后細胞置于染色管中，加上2～3mL的洗液，離心5分鐘500g，然后用FACS通透液通透與染色。
三、 選擇、制備、儲存試劑
激活劑(BD 不提供)
1．Phorbol 12-Myristate 13 Acetate(PMA)(Sigma Cataog No.P-8139)
a. 于DMSO中調節濃度0.1mg/mL
b. 分裝(20mL)，－20℃儲存。勿反復凍融
c. 每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：100稀釋儲存液
d. PMA終濃度25ng/mL細胞懸液。
2．Ionomycin (sigma Catalog No.I-0634)
a. 于乙醇中配制成濃度0.5mg/mL
b. －20℃儲存。
c. 每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液
d. Ionomycin終濃度1mg/mL細胞懸液。
3．Staphylococcal enterotoxin B(SEB) (sigma Catalog No.S-4881)
a. 無菌無疊氮鈉PBS調節濃度0.5mg/mL
b. 4℃儲存。
c. SEB終濃度10mg/mL細胞懸液。
4．Brefeldin-A(BFA) (sigma Catalog No.B-7651)
a. 于DMSO中調節濃度5mg/mL
b. 分裝(20mL)，－20℃儲存。勿反復凍融。
c. 每次實驗用無菌無疊氮鈉PBS 1：10稀釋儲存液
d. 激活最后4－5小時BFA終濃度10mg/mL細胞懸液。
注意：BFA過度孵育會導致細胞活力下降。
5．不含谷氨酰胺的RPMI-1640
6．無菌無疊氮鈉PBS
7．DMSO(sigma Catalog No.D－8779)
8．乙醇
9．洗液，含0.5%BSA與0.1%NaN3 , 4℃儲存。
10．含1%多聚甲醛的PBS，4℃儲存。
11.細胞表面染色的標記熒光單抗試劑
依據實驗需要選擇特殊表面標志
CD45-PerCP圈定所有淋巴細胞
CD3-PerCP圈定T淋巴細胞
CD4-PerCP或CD8-PerCP圈定特定T淋巴細胞亞群
CD19-PerCP或CD20-PerCP圈定B淋巴細胞
CD56-PerCP圈定NK淋巴細胞
CD14-PerCP圈定單核細胞
12.FACS溶血素
FACS溶血素(BDIS Catalog No.349202)用于PBMCs，培養細胞與全血制備，主要有3個作用：
1、全血制備時用于溶解紅細胞
2、固定外表位
3、輔助通透劑
FACS溶血素使用前用無離子水1：10稀釋，勿用PBS或其它緩沖液。