湖北農科院用CRISPR制備基因敲除克隆豬

　　來自湖北省農科院畜牧獸醫研究所、河南科技大學和中科院水生生物研究所的研究人員，用CRISPR/Cas9系統和Cre/LoxP，敲除了豬初生細胞中肌生成抑制蛋白（MSTN）的一個等位基因，制備了無選擇標記的MSTN基因敲除克隆豬。相關研究結果發表在8月17日的《Scientific Reports》雜志。湖北省農科院畜牧獸醫研究所的鄭新民研究員和河南科技大學動物科學學院的董發明教授，是本文共同通訊作者。

　　可預測的、無污染的轉基因家畜，對于可靠的表型和生物安全，都是很重要的。因為不想要的序列的引入，如SMGs（選擇標記基因），已經引起了公眾對于食品安全、生物多樣性和農業生態系統的強烈擔憂。SMGs經常用于細胞介導的轉基因，使我們能夠分離出轉基因細胞。但是一旦操作完成，它們在從這些細胞制備而來的GM家畜中，就沒有任何價值，相反，殘留在家畜中的SMGs還可能成為一種負擔。

　　有幾種方法可以用來制備無SMG的轉基因家畜。然而，到目前為止，這些方法固有的技術局限性，阻礙了無污染轉基因方法的常規使用。例如，將一個表達 組件直接顯微注射到受精卵中，可避免任何SMG的使用，但是效率非常低、隨機整合并存在潛在的嵌合現象，從而導致這種方法是不切實際和昂貴的。相反，傳遞 mRNA或編碼蛋白質的可編程核酸酶（如CRISPR/Cas9），已被證明是制備無SMG轉基因家畜的一種有效策略。

　　Cre/LoxP重組系統被廣泛用于轉基因小鼠，用以組織特異性的基因打靶以及基因切除。然而，Cre/LoxP在轉基因家畜中仍未得以很好的研究，只有少數研究描述了它在大型動物中的效用。

　　在這項研究中，研究人員通過CRISPR/Cas9和Cre/LoxP制備了無SMG的功能性MSTN（肌生成抑制蛋白）基因敲除克隆豬。他們利用 CRISPR/Cas9介導的同源重組（HR），來敲除豬初生細胞中MSTN的一個等位基因。然后，用Cre重組酶來切除SMG，有效率為82.7%。研 究人員通過流式細胞儀分離出了無SMG的非EGFP細胞，并被立即用作供體細胞核用以核移植。分子測試在這項克隆豬中驗證了單等位基因MSTN KO和SMG刪除。免疫印跡顯示，在MSTN中大約有50%的降低，同時肌原性基因在肌肉中的表達有所增加。組織學檢查顯示，肌纖維數量增加，但是肌纖維 大小保持不變。超聲波檢測顯示，最長肌大小增加，背脂肪厚度降低。豬MSTN基因的精密編輯，產生了無SMG的MSTN KO克隆豬，提供了一種可靠的途徑用于家畜良種生產，也提出了一種策略來減少潛在的生物學風險。

　　另外在今年6月，Nature子刊《Scientific Reports》在線刊登了同濟大學、中科院上海生命科學研究院、上海交通大學以及加州大學洛杉磯分校的一項研究成果。在這項研究中，研究人員用 CRISPR技術制備了一組Lep突變大鼠，它們在成熟LEP蛋白中攜帶14th Ile (LEP?I14)無效突變或者缺失。

　　肌生成抑制蛋白（Mstn）是哺乳動物骨骼肌質量的一個保守的負調節因子。然而，在家畜中是否能夠實現Mstn的精確敲除，能否被安全地用來提高產 肉性能，尚未得到證實。近期，來自南京農業大學、斯坦福大學等處的研究人員，在Nature子刊《Scientific Reports》發表題為“Generation and evaluation of Myostatin knock-out rabbits and goats using CRISPR/Cas9 system”的研究成果，該研究利用CRISPR/Cas9來制備Mstn基因敲除家兔和山羊，然后分析了它們的表型變化，對上述問題進行了探討。

　　到目前為止，密切模擬人類病理和行為缺陷的神經系統疾病猴模型，還沒有被成功地制備出來。8月9日，國際學術期刊《Cell Research》在線刊登了我國科學家的一項重要研究成果，這項研究采用TALEN技術，制備了小頭畸形致病基因MCPH1突變體食蟹猴模型，并對這種 MCPH猴模型的表型進行了描述。