清華教授NatCommun發表論文：質譜的單細胞脂質組學分析

　　單細胞分析是研究細胞異質性的關鍵技術，對生物學過程研究及新藥研發有著重要意義。目前，單細胞基因組學技術較為成熟，單細胞轉錄組學和蛋白組學分析技術近年來獲得較多關注和投入。與其他組學相比，單細胞脂質組學分析剛剛起步，面臨諸多技術難點。由于脂質數量龐大，結構復雜，其在單細胞層面的結構表征和定量分析頗具挑戰。質譜儀因其高靈敏度、高特異性和準確定量能力，已成為單細胞脂質組分析的主要技術。然而，單個細胞內脂質等代謝物的精細結構鑒定（如碳碳雙鍵位置和sn-位置）與定量分析仍面臨著巨大挑戰。

　　 脂質的結構異常復雜，根據頭基的不同，可將脂質劃分為不同類型。此外，脂質的脂肪酸鏈（fatty acyl chain）、脂肪酸鏈位置（sn-position）、碳碳雙鍵位置（C=C location）、雙鍵幾何構型（cis/trans）等結構特征均可變化，造成脂質異構體數量繁多。近年來，研究者們開發了多項技術，用于脂質的精細結構鑒定，包括臭氧誘導解離、環氧化和光化學（Paternò-Bǜchi，PB）反應等。同時，多項單細胞內脂質分析技術也已報道，包括探針電噴霧質譜、流式電噴霧質譜和單探針質譜等。然而，由于單細胞內的待測物絕對含量低和結構分析方法缺失等限制，單細胞內脂質精細結構的解析仍面臨著重大挑戰。

　　 近日，清華大學精密儀器系馬瀟瀟副教授和歐陽證教授帶領研究團隊，發展了一種基于質譜的新型單細胞脂質組精細結構分析方法。該技術利用自由基誘導解離、PB反應與多級質譜技術，實現了單細胞內脂質sn-位置異構體和C=C位置異構體的鑒定與相對定量，解決了哺乳動物單細胞內大規模脂質的精細結構分析這一關鍵技術難題。該技術的基本原理如圖1所示：首先利用戊二醛對固定細胞進行固定，使細胞在水溶液保持形態完整。在電遷移和液滴輔助電噴霧作用下，固定后的單細胞完成實現高靈敏度質譜檢測（圖1b）。細胞固定后，磷脂酰膽堿（PC）的回收率可達90%以上。采用水溶性2-乙酰吡啶（2-AP）作為反應試劑，有效避免了衍生過程中細胞脂質的溶解問題。

　　圖1. 單細胞脂質組的質譜精細結構技術（a）單細胞脂質精細結構解析流程圖,（b）基于電遷移和液滴輔助電噴霧（DAESI）的單細胞質譜分析，（c）未固定和固定的細胞提取液內前級離子掃描（PIS）m/z 184掃描質譜圖，（d）戊二醛固定下的PC回收率統計，（e）單細胞群體獨立光化學衍生反應裝置圖。

　　 結合串聯質譜分析，研究人員實現了對單細胞內脂質C=C位置異構體的鑒定和相對定量分析。以單個MDA-MB-231中的PC 34:1（m/z 760）為例，其PB產物離子（m/z881）在串級質譜下可以產生三對診斷離子：636/725，650/739和678/767，分別代表PC 16:0_18:1(Δ8), PC 16:0_18:1(Δ9)和PC 16:0_18:1(Δ11)。進而利用這些診斷離子的相對強度即可實現相應脂質異構體的相對定量分析（圖2a）。除PC外，該技術還可以用于脂肪酸（FA）、甘油二脂（DAG）、甘油三酯（TAG）、膽固醇酯（CE）等其他脂質的分析（圖2b, c）。此外，還實現了單細胞內脂質sn位置異構體的鑒定和相對定量分析。以人乳腺癌MDA-MB-231細胞內的PC 34:1為例，其碳酸氫根加合物經多級質譜分析可產生兩個sn特異性診斷離子，419和445，代表PC 16:0_18:1和PC 18:1_16:0。液滴輔助電噴霧使得單細胞多次采樣和分析成為可能。實驗結果表明，該技術可對單細胞進行至少八次采樣，可實現多個脂質分子的精細結構鑒定和相對定量。

　　圖2. 單細胞內脂質的精細結構解析。（a）單個MDA-MB-231內PC 34:1的C=C位置鑒定,（b）單個MCF-7內FA 18:1的C=C位置鑒定，（c）單個MCF-7內DAG 36:2的C=C位置鑒定，（d）單個MDA-MB-231內PC 34:1的sn位置鑒定。

　　 該研究中，隨后開展了對野生型（HCC827）和耐藥型（HCC827/GR6）非小細胞肺癌（NSCLC）細胞的單細胞精細脂質組學分析。從脂質分子相對定量、脂質sn位置異構體相對定量和脂質C=C位置異構體相對定量等層次分別開展研究（圖3.a-d）。t-SNE降維聚類分析表明，僅脂質C=C位置異構體的相對定量分析能準確區敏感和耐藥肺癌細胞。該團隊在HCC827中檢測到了約9%的耐藥細胞，與文獻報道的7~12%的結果高度一致，表明單細胞精細脂質組學分析在精準醫療方面具有不可替代的重要作用。

　　圖3. 敏感型和耐藥型NSCLC細胞的精準識別。（a-c）t-SNE降維聚類圖，（a）由脂質分子相對含量分布計算而得,（b）由脂質sn位置異構體相對含量計算而得，（c）由脂質C=C位置異構體相對含量計算而得。（d）每種聚類分析中樣品數目統計。（e）敏感型與耐藥型細胞中含有C16:1(Δ9)或C18:1(Δ11)的PC 32:1異構體相對含量比較。***p<0.001。（f）HCC827和HCC827/GR6單細胞內PC 32:1的C=C位置異構體相對含量分布。

　　 最后，以四個典型單細胞為例，闡釋了同一細胞系內不同細胞間的異質性，并研究了可用于耐藥NSCLC細胞精準識別的潛在生物標志物。通過定量分析可以發現，含有C16:1(Δ9)或C18:1(Δ11)的PC 32:1異構體相對含量在耐藥型NSCLC細胞內含量為41.0±5.1%，在敏感型NSCLC細胞內含量為55.7±4.9%，可用于敏感和耐藥細胞區分。例如，在來自HCC827細胞系的細胞1,3中，細胞1屬于敏感型，細胞3屬于耐藥型；在來自HCC827/GR6細胞系的細胞2,4中，細胞2屬于耐藥型，細胞4屬于敏感型。以上結果表明相同細胞系內的單細胞之間存在顯著異質性，為耐藥型和敏感型NSCLC細胞的區分提供了關鍵技術，對癌癥等疾病的精準診療具有重要意義。

　　 本研究的相關結果已發表于Nature Communications。該論文得到了國家自然科學基金項目的支持。