【摘要】 目的 觀察β淀粉樣蛋白(Aβ) 腦室內注射建立阿爾茨海默病(AD) 大鼠模型及其對大鼠行為、膽堿乙酰轉移酶(ChAT)活性、細胞凋亡、神經生長因子(NGF) 水平等影響。方法 將Aβ1242 注射入大鼠側腦室,于第1 周、2 周、4 周觀察Morris 水迷宮逃避潛伏期、測定腦內ChAT 活性、進行原位末端標記凋亡染色及NGF 免疫組化染色。結果 Aβ1242 注射后第2 周大鼠Morris 水迷宮逃避潛伏期延長,4 周時更明顯。2 周后海馬、皮層ChAT 活性下降,4 周后腦內ChAT 活性廣泛下降,以海馬最為顯著。2 周后基底前腦Meynert核區凋亡細胞較其他腦區增多,NGF 陽性細胞明顯減少。結論 Aβ腦室內注射可以模擬AD 行為改變,使腦內ChAT 活性降低,基底前腦NGF 含量減少,膽堿能神經元凋亡,可以作為AD 研究模型。
【關鍵詞】 阿爾茨海默病 β淀粉樣蛋白 膽堿乙酰轉移酶 神經生長因子
【中圖分類號】 R749. 1 【文獻標識碼】 A
阿爾茨海默病(Alzheimer Disease , AD) 發病的中心環節是β淀粉樣蛋白(β2amyloid protein ,Aβ) 在腦中的沉積[1 ] ,多種神經元尤其是膽堿能神經元原發性變性,腦內膽堿乙酰轉移酶(cholineacetyl transferase ,ChAT) 活性下降,是AD 的標志性生化改變[2 ] 。AD 等神經系統變性疾病與細胞凋亡的發生密切相關[3 ] ,而神經生長因子(nerve growth factor ,NGF) 是中樞膽堿能系統重要的神經營養因子,具有明顯的抗凋亡作用[4 ] 。
AD 基礎研究和藥物開發的最大障礙是缺乏一種與AD 病理、生化、和行為等改變相似的理想動物模型。本實驗通過Aβ腦室內注射建立AD 大鼠模型,觀察大鼠行為學改變、腦內各部位ChAT 活性變化、神經元凋亡情況,以及NGF 水平改變,為進一步的AD 治療研究提供動物模型。
1 材料與方法
111 動物分組及Aβ腦室內注射 雄性Wistar 大鼠48 只,體重260～300 g ,隨機分為4 組:對照組、Αβ注射后7 天組、14 天組、28 天組,每組12 只。大鼠麻醉后用微量注射器緩慢將藥物注入右側腦室(前囪后018 mm ,中線旁開111 mm ,深度316 mm) 。Aβ模型組注射Aβ1242 (購自美國AnaSpec 公司) ,每次7 μg ,連續3天,對照組注射生理鹽水,每次7μL ,連續3 天。
112 Morris 水迷宮試驗 參照文獻方法[5 ] ,記錄大鼠找到平臺所需逃避潛伏期。各實驗組分別于最后1 次藥物注射后第5～7d ,12～14 d ,26～28 d 進行試驗,對照組同時試驗。
113 取材 Aβ注射組分別于最后1 次藥物注射后第7 天、14天、28 天宰殺取材,對照組于最后1 次藥物注射后28 天取材。每組取6 只快速斷頭取腦,立即凍于液氮中,待測ChAT 活性。另6 只4 %多聚甲醛透心灌注后于4 %多聚甲醛溶液中固定72小時以上,進行TUNEL 凋亡染色及NGF 免疫組化染色。
114 ChAT活性檢測及定量分析 液氮中凍存腦組織分別取海馬、基底節、額葉、頂葉皮層制備5 %(V/ W) 腦組織勻漿, 按照Fonnum[6 ]的放免方法,在70μL 總反應體積中,含試樣液或空白對照液20μL ,1114 g/ L 乙酰輔酶A(Sigma 公司) 10μL ,70 mmol/L 膽堿(Sigma 公司) 8μL ,1 mmol/ L 溴化新斯的明(Sigma 公司) 7μL ,3 mmol/ L 氯化鈉7μL ,317 ×104 Bq/ mL 14C2乙酰輔酶A 10μL ,在液體閃爍儀上測定每分鐘衰變數(cpm) 。以對照組各部位衰變數為100 % ,計算各組各部位ChAT 相對活性。
115 TUNEL 凋亡染色及半定量分析 選取基底節、海馬、額葉、頂葉同時存在矢狀斷面切片,按TUNEL 凋亡染色試劑盒(武漢博士德公司) 說明書操作,進行TUNEL 細胞凋亡染色。每只鼠腦染色2 張切片,每一切片高倍視野(400 ×) 下每部位取4 個視野共計數100 個神經元,計算凋亡神經元陽性百分率,即神經元凋亡指數(NAI) 。
116 NGF 免疫組化染色及圖像分析 取上述石蠟切片,按NGF免疫組化試劑盒(武漢博士德公司) 說明書操作染色。每只鼠腦染色2 張切片,每一染色片高倍視野(400 ×) 下取5 個視野,用美國UIC 公司Metamorph Image System V416 圖像分析軟件得出陽性染色細胞平均灰度值(Average gray value Average) 。
117 統計學分析 計量資料用均數±標準差( x ±s) 表示,各組間ChAT 活性、水迷宮試驗潛伏期、NGF 陽性神經元平均灰度值比較采用t 檢驗,神經元凋亡指數組間比較采用χ2 檢驗。