汪陽明組“miRNA與sgRNA聯姻”打造基因編輯體系控制新平臺

　　miRNA是一類長度約22個堿基的核糖核酸分子，廣泛表達于植物，動物以及病毒中。miRNA通過與Argonaute (AGO)等蛋白形成RNA誘導沉默復合物（RNA Induced Silencing Complex，RISC），在轉錄后水平抑制基因表達【1，2】。其表達譜呈現細胞特異性【3】，即特定細胞一般會大量表達某一個或幾個miRNA，例如，心臟細胞中的miR-1，肝臟細胞中的miR-122；不同的癌癥組織甚至相同癌癥的不同階段也會特異表達不同的miRNA。因此，特定miRNA或者幾種miRNA組合的表達可以用作指征細胞發育和疾病狀態的標志物。理論上，這種高度特異性信息可以被應用于控制報告基因或者內源基因的特異性表達，以此實現標記或者操控特定細胞。然而，由于miRNA具有抑制基因表達的天然屬性（特殊情況除外），迄今尚未有直接、靈敏且正向反應miRNA活性的生物傳感器。

　　而來自于微生物的II型規律成簇短回文重復序列系統（Type II CRISPR）自從2012年被改造為基因編輯工具后【4】，帶來了生物學研究、疾病治療以及農作物育種等方面的一系列革命性進展，并有望在未來持續改變世界。但是，如何精確地實現CRISPR只在特定類型細胞中執行工作仍是該技術面臨的一大難題。

　　有意思的是，當研究人員將miRNA傳感器和精準控制CRISPR體系結合在一起考慮的時候，上述兩個問題都迎刃而解。

　　北京大學分子醫學研究所汪陽明研究組長期從事非編碼RNA在干細胞的自我更新與分化過程中的功能及其作用機理，最近該課題組發明了一種由微小核糖核酸(miRNA)控制CRISPR開啟的技術平臺，開發出了在活細胞中監測miRNA活性的傳感器，成功實現了CRISPR基因編輯體系的細胞特異調控。該項成果以A microRNA-inducible CRISPR-Cas9 platform serves as microRNA sensors and cell type specific genome regulation tools為題于2019年2月25日在線發表于Nature Cell Biology雜志。

　　CRISPR基因編輯體系分為兩個部分：一個由蛋白質（Cas9或者Cas9突變體融合蛋白）組成，執行基因編輯或控制基因表達的任務；另一個是sgRNA，介導Cas9蛋白質在基因組特定位置的結合【4】。研究人員通過設計具有miRNA結合位點的沒有活性的sgRNA前體，使得只有在特定miRNA表達的細胞中，才會通過miRNA介導的切割反應產生成熟的sgRNA,繼而引導CRISPR基因編輯體系啟動工作（圖1）。

圖1：MICR，miRNA誘導啟動的CRISPR基因編輯平臺

　　該研究中發明的miRNA誘導啟動的CRISPR基因編輯平臺（MICR，miRNA-inducible CRISPR-Cas9 platform），簡單地說，就是給基因編輯平臺安上了一個開關，這個開關只有特定miRNA才能打開，因此只在表達特定miRNA的細胞或組織中開啟基因編輯，而不影響其他組織和細胞。由于miRNA和siRNA切割RNA的機理相同，因此MICR也可以用作感知外源或內源siRNA的傳感器。MICR的發明實現了對CRISPR基因編輯系統的精準控制，有望增強相關基因編輯技術在疾病治療過程中的安全性和有效性。

　　在該研究中，通過將MICR與熒光蛋白表達相偶聯，研究人員首先成功實現了活細胞水平miRNA活性的可視化監測，熒光蛋白的表達水平與細胞中的miRNA的拷貝數在大約10-5000的范圍內（更高拷貝數的情形尚未測定）呈現正相關。接著，研究人員構造了miR-294和miR-1控制的熒光蛋白報告平臺，分別用來監測了胚胎干細胞和肌肉前體細胞的分化狀態，結果顯示細胞的分化狀態與miRNA活性水平呈現很好的相關性。當將sgRNA前體設計成靶向內源基因時，他們還成功實現了細胞特異性地激活或者抑制內源基因表達。另外，當將Cas9效應蛋白換成堿基編輯器(Base Editor)時，MICR可以在miRNA的誘導下精準編輯染色質上的精確位點。最后，利用MICR報告基因平臺監測胚胎干細胞中不同miRNA的表達活性，研究人員首次在胚胎干細胞中發現了miR-21活性呈現不均一調控的異質性現象，且該異質性與干細胞發育和分化相關基因的表達水平顯著關聯，這一發現為miRNA的研究拓展了潛在的新方向。這些研究表明MICR可以被用來實現活細胞中的miRNA活性監測以及細胞特異性地控制CRISPR基因編輯體系，包括激活、抑制以及堿基編輯等。

　　在MICR的設計中，由于sgRNA的數目不受限制，因此該平臺可以感知多個miRNA并對不同基因位點進行精準調控。作為這一概念的佐證，研究人員進行了簡單的“或門”計算，并成功實現了在同一細胞中感知兩種miRNA分別開啟綠色或紅色熒光蛋白表達(圖2）。理論上，如果設計sgRNA感應N種不同的miRNA并控制不同的基因表達，則可以達到2N種不同的輸出結果。對于多個miRNA的感知可以進一步增強MICR體系的細胞特異性。

圖2：利用MICR感知兩種不同的miRNA控制熒光蛋白表達

　　MICR平臺有望廣泛應用于動植物及病毒相關系統的研究，并且MICR平臺具有兼容性，可以和其他控制CRISPR的技術，如小分子和光遺傳學相關技術聯合使用，為合成生物學、基于基因編輯體系的基因治療提供新的技術手段和思路。值得一提的是，相關發明目前已申請ZL兩項。

　　據悉，北京大學分子醫學研究所汪陽明博士為該研究的通訊作者，2013級博士生王茜雯和胡魯峰為該論文共同第一作者，郝菁、廖樂祺、邱雅姿和石銘參與工作。

　　參考文獻

　　1，Hutvagner, G. & Zamore, P.D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex. Science 297, 2056-2060 (2002).

　　2，Zeng, Y., Yi, R. & Cullen, B.R. MicroRNAs and small interfering RNAs can inhibit mRNA expression by similar mechanisms. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100, 9779-9784 (2003).

　　3，Landgraf, P. et al. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell 129, 1401-1414 (2007).

　　4，Jinek, M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 337, 816-821 (2012).