江蘇大學檢驗醫學專業實驗臨床免疫學檢驗

　　抗血清的制備

　　【原理】：用抗原刺激機體可以產生抗體，抗原的性質、純度和活性影響其免疫動物后獲得的抗體的的特異性和效價。在體外有目的的制備抗原，經初次、再次免疫的過程可以獲得高質量的抗體。

　　【注意事項】

　　①制備佐劑時，一定要順著同一方向用勁磨。

　　②檢查油包水的方法：培養皿內加水，滴入混勻液，不散開即可。如果第1次檢查不合格，第2次檢查必須重新倒水在平皿。

　　③免疫動物皮內注射時，可以在足墊、腋下、 背部等處多點注射，總劑量1ml/只。

　　凝集反應：顆粒性Ag或可溶性Ag（Ab）與載體顆粒結合成的致敏顆粒，與相應Ab（Ag）發生特異性反應。在一定條件下，形成肉眼可見的凝集現象。

　　一、直接凝集反應：顆粒性Ag與相應Ab直接結合，在一定條件下，形成肉眼可見的凝集現象。

　　（1）玻片法凝集反應：

　　【原理】：顆粒性Ag（細菌、紅細胞等），與相應Ab直接結合。在一定條件下，形成肉眼可見的凝集現象。

　　【意義】：①定性試驗，可用已知抗體的診斷血清來測未知的抗原。②可用于細菌分型、ABO血型鑒定等。

　　【結果觀察】：

　　①對照區不發生凝集，為均勻渾濁的乳狀液。

　　②試驗區，傷寒菌液（Ag）與相應的Ab發 生反應，出現肉眼可見的凝集塊，為陽 性。 如與對照相同則為陰性。

　　（2）試管法凝集反應：

　　【原理】：用已知細菌作為一定濃度的懸液Ag，與一系列稀釋的受檢血清混合，經靜置保溫后觀察每管內顆粒性Ag的凝集程度。

　　【結果觀察】：

　　①先看對照管，應無凝集現象，輕搖試管，細菌分散均勻， 混濁。再從第1管開始看。

　　②根據凝集度打“+”。

　　—： 管底無沉淀,液體混濁，細菌分散均勻。

　　++++： 管底有沉淀,上液澄清，細菌全部凝集。

　　+++： 管底有沉淀,液體稍混, 細菌1/4不凝集。

　　++: 管底有沉淀,液體混濁，細菌1/2不凝集

　　+: 管底僅少量有沉淀,液體混濁。

　　效價判斷：以出現“++”凝集的最大稀釋度，為該血清的凝集效價。

　　二、間接凝集反應：必須借助顆粒性載體，將可溶性Ag（Ab）致敏載體，成致敏顆粒，再檢測標本中相應的Ab（Ag）。

　　間接凝集反應（膠乳凝集抑制試驗）：

　　【定義】：間接凝集反應：將可溶性Ag掛在一個無 關免疫的載體(聚苯乙烯膠乳)上，制備成顆粒Ag,與其相應的Ab相結合,為間接凝集反應。

　　以檢測尿中HCG為例：

　　陽性：尿含HCG+抗HCG → +HCG膠乳顆粒 → 不凝集

　　陰性：尿不含HCG+抗HCG → +HCG膠乳顆粒 → 凝集

　　沉淀反應

　　【定義】：可溶性Ag + 相應Ab → 形成肉眼可見的沉淀物質（Ag-Ab復合物）

　　一、對流免疫電泳

　　【原理】：利用電場的作用加強和加快雙向擴散的一種方法。

　　在pH8.6的堿性緩沖液瓊脂中進行電泳，帶有較多負電荷的Ag泳向陽極，而Ab球蛋白等電點偏高（約為6--7），在pH8.6時帶負電荷較少，加上分子量較大，泳動慢，受電滲（指電場中液體對固體支持物的相對移動）干擾后向陰極倒退，這樣抗原抗體作相對運動，在較短時間內即可相遇，在孔間兩者分子比例合適的地方形成沉淀線。

　　【意義】： 對流免疫電泳主要用于檢測標本中的抗原如AFP、HBsAg等。本法較雙向瓊脂擴散時間大為縮短（一般只需30分鐘到1小時），且靈敏度比雙擴高約數十倍。

　　沉淀線的位置與Ag、Ab分子電荷情況有關，也與 Ag、Ab比例有關。有沉淀線為陽性，無沉淀線為陰性。

　　【特點】

　　優點：操作簡便，觀察結果快，敏感度比雙擴高8-16倍。

　　缺點：分辨率差，當有多種Ag、Ab 系統存在時，形成 的沉淀線位置易重疊，難以分辨，所以用此目的 時，不如雙擴。

　　二、雙向瓊脂擴散實驗

　　【原理】：定性試驗。將可溶性抗原與相應抗體分別加入瓊脂板上相對應的孔內，抗原抗體從孔內向四周擴散，在兩者對應比例適宜處形成沉淀線。

　　【意義】：可用已知抗原（抗體）來檢測未知的抗體（抗原），同時檢測抗原抗體的純度。臨床上常用來檢測甲胎蛋白（AFP），作為原發性肝癌等的輔助診斷。

　　【結果判斷】：

　　①在陽性對照孔與中間的抗體孔之間出現一條或多條白色沉淀線（一對抗原抗體系統即可出現一條沉淀線，如有多對抗原抗體可出現多條沉淀線）。

　　②觀察標本孔與中間的抗體孔之間有無出現沉淀線，有即為陽性，無即為陰性。

　　以上兩實驗的注意事項：

　　①澆瓊脂板時注意動作要迅速，瓊脂不要溢出玻片，成品瓊脂板平整無氣泡，打孔時，不要將瓊脂 劃 破；②加樣時，不要溢出孔外；③加樣用的槍頭不要混用。

　　三、免疫電泳

　　【原理】：區帶電泳后進行雙相瓊脂擴散實驗。

　　將待測標本置于瓊脂凝膠中電泳，樣品中各蛋白成分因分子量及電泳遷移率不同，被分成肉眼不可見的若干區帶。電泳結束后，沿與電泳方向平行的兩側開槽并加入抗血清，置室溫或37度使兩者擴散。18-24h后，各區帶蛋白與相應的Ab在相應的位置上形成弧形沉淀線。Ag越多，沉淀線越靠近Ab槽，其沉淀線越粗，可做細微的蛋白質組分分析，僅為定性實驗。

　　【用途】：定性實驗，主要用于純化Ag和Ab成分的分析及正常和異常免疫球蛋白的識別和鑒定等方面。

　　【注意事項】：①開槽處距玻片邊緣>5mm,開孔處>7.5mm。②槽中加抗血清時，加滿即可，切忌溢出。

　　四、單向瓊脂擴散電泳

　　【原理】：單向瓊脂擴散擴實驗是凝膠內免疫沉淀反應定量試驗。一般是用已知抗體測定未知量的相應抗原。定量抗體與加熱熔化的含緩沖液的瓊脂混合后，制板，打孔，加入待檢抗原，在合適條件下，形成乳白色的沉淀環。沉淀環大小與抗原（抗體）量成正相關，因而可以根據沉淀環的大小確定相應抗原（抗體）的量。

　　【意義】：單向免疫擴散試驗主要用于血清中IgG、IgM、IgA和補體等蛋白質的定性、定量測定。

　　以上兩實驗的注意事項：

　　制備抗體瓊脂板時，瓊脂溫度必須嚴格控制。溫度太低會導致瓊脂凝固，太高將影響所加抗體的活性。

　　加樣孔中的瓊脂應挑干凈，且不可損壞孔的邊緣，確保每孔的液面基本一致。

　　ELISA（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）

　　該技術基礎是抗原或抗體固相化和酶標記的抗體或抗原，固相化和酶標記的抗原抗體仍保持其免疫活性。

　　在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其它物質分開，最后結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量有一定的比例，加入酶反應的底物后，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據顏色反應的深淺進行定性或定量分析。

　　常用的ELISA的方法有：間接法、夾心法、競爭法

　　乙肝兩對半：

　　乙型肝炎病毒抗原 → 人體產生的相應抗體

　　HBsAg → HBsAb 、 HBeAg → HBeAb 、(HBcAg) → HBcAb

　　大三陽 ：HBsAg，HBeAg，HBcAb陽性。 小三陽 ：HBsAg，HBeAb，HBcAb陽性。

　　【實驗目的】：定性或定量測定人血清或血漿中乙型肝炎病毒表面抗體（抗HBs),可用于判斷乙型肝炎疫苗接種效果和乙型肝炎病毒感染的治療效果和預后情況。

　　【實驗原理】：雙抗原夾心法檢測人血清或血漿中的抗-HBs（一步法）。

　　采用純化HBsAg包被反應板，加入待測標本，同時加入HBsAg-HRP進行孵育，當標本中存在抗-HBs時，該抗體與包被HBsAg結合并與酶結合物形成HBsAg—抗HBs—HBsAg—HRP復合物。洗去游離反應物，加入顯色劑后，將有明顯顏色變化。若標本中無抗-HBs時，加入底物后沒有或只有很輕微的顏色變化，在一定范圍內，顏色的深淺變化與標本的含量呈正比。

　　【結果判斷】

　　未加終止液前，陽性孔呈藍色，陰性孔和空白孔無色，標本孔如呈藍色即為陽性，顏色深淺與標本中的抗HBs量呈正比。

　　加終止液后，藍色轉為黃色，放入酶標儀中檢測，使用OD450-492nm波長測定OD值，計算cutoff值，讀數需在終止反應后１０分鐘內完成。

　　cutoff值：COV=陰性對照平均OD值×2.1

　　標本OD值≥COV為陽性，標本OD值≤COV為陰性。陰性對照OD值低于0.05，作0.05計算，高于0.05按實際OD值計算。

　　免疫熒光色素技術

　　許多物質都可產生熒光現象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：

　　①異硫氰酸熒光素（FITC）：為黃色或橙黃色結晶粉 末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，最大吸收光波長為490-495nm，最大發射光波長520-530nm，呈現明亮的黃綠色熒光，是應用最廣泛的熒光素。其主要優點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。

　　②四乙基羅丹明；③四甲基異硫氰酸羅丹明等。

　　【實驗原理】：利用熒光標記第二抗體檢測未知Ag或未知Ab的方法。以檢測人血清中抗核抗體（ANA）為例。

　　小鼠肝細胞作為抗原片，將病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就會與細胞核成分發生特異性結合，再加入熒光素標記的抗人IgG又可與ANA結合，在熒光顯微鏡下細胞核部位呈現熒光。

　　以檢測血清中ANA(抗核抗體)為例。

　　鼠肝細胞 + ANA（1：5血清），一抗 + 抗人IgG-FITC，二抗 → 熒光顯微鏡下觀察 → 無熒光為陰性，有熒光為陽性

　　【實驗結果】

　　細胞核發黃綠色熒光為“+”，陽性待檢血清作進一步稀釋后可測定效價。不發熒光為“-”。

　　根據細胞核著染熒光的圖像，可區分為：

　　①均質性：細胞核呈均勻一致的熒光。

　　②周邊性：核周呈現熒光。

　　③斑點型（顆粒型）：核內呈現斑點狀熒光。

　　④核仁型：核仁部分呈現熒光。

　　⑤混合型：兩種以上核染色。

　　【注意事項】：抗原片要新鮮，厚薄一致，要盡量薄。待檢血清要新鮮。沖洗時要干凈，動作要輕柔。觀察結果要及時，以免熒光湮滅。

　　補體CH50實驗

　　【實驗原理】：補體與抗體（溶血素）致敏的羊紅細胞接觸后，被激活（C1途徑），從而使致敏的SRBC溶解，其溶血程度與補體量呈正比。因此，將新鮮待檢血清做不同稀釋后，與致敏紅細胞反應，測定溶血程度，以50%溶血時的最小血清量判定終點，可測知補體總溶血活性。以50%溶血判斷結果比100%溶血靈敏、準確。

　　溶血素+SRBC，在補體的作用下 → 溶血

　　【實驗結果】

　　①對照管不溶；②目視比較，最接近標準管的一管。

　　根據U管中加入的血清量，求出總補體值：補體活性（u/ml）=1/血清量（ml）×稀釋倍數（20）

　　③無法目測的，用722在542nm處讀T值也可。

　　大小吞噬實驗

　　【實驗目的】：體內具有吞噬功能的細胞稱為吞噬細胞，主要包括血液中的中性粒細胞、單核細胞和組織中的巨噬細胞。通過測定細胞的吞噬率、吞噬指數可了解吞噬細胞的吞噬功能。

　　一、小吞噬試驗

　　【實驗原理】：中性粒細胞具有很強的吞噬殺菌功能，當與顆粒性物質（細菌等）混合孵育一定時間后，顆粒性物質被吞噬殺滅。根據吞噬率、吞噬指數可反映該細胞的吞噬功能。

　　【結果觀察】：鏡下可見RBC被染成紅色，其它為藍色，找到中性粒細胞，計算吞噬率及吞噬指數。

　　吞噬率（%）= 200個中性粒細胞中吞噬細菌的細胞數/200 × 100 %

　　吞噬指數= 200個中性粒細胞中吞噬的細菌總數/200

　　二、大吞噬試驗

　　【實驗原理】：血液中的大單核細胞游走至組織中形成 巨噬細胞，有吞噬顆粒性物質的功能。

　　【實驗結果】：鏡下可見梭形雞RBC 被巨噬細胞吞入胞漿內。

　　【注意事項】：

　　①、5%淀粉的作用：注射豚鼠后，誘導血液里 的單核細胞進入組織里，變成巨噬細胞。

　　②、5%雞RBC：有核，梭形，染色后核為藍 色，周圍為紅色。

　　③、巨噬細胞在吞噬后形態會不規則，不易找到；所以可先找到有核的雞RBC，看是否被其他細胞包裹。如果包裹物也有核，則為巨噬細胞。

　　PFC（溶血空斑形成試驗）

　　【定義】：溶血空斑形成試驗是一種體外檢測單個抗體形成細胞（漿細胞）的方法。故又稱體外抗體形成細胞測定技術。

　　【實驗目的】：測定抗體生成細胞功能（B細胞產生抗體的能力）。

　　【實驗原理】：將經SRBC免疫過的小鼠脾細胞與一定量的SRBC混合，在補體參與下，使抗體形成細胞周圍那些受到抗體分子致敏的綿羊紅細胞溶解。

　　抗體生成細胞 （已致敏）+ Ag(SRBC) + 補體 → 溶血

　　【結果判斷】取上清，722上413nm比色，檢測上清中SRBC裂解釋放的血紅蛋白量（以OD值反映補體溶解SRBC的程度；OD值越大，則裂解釋放的血紅蛋白量越大，產生的抗體越多）。

　　淋巴細胞功能測定系列實驗

　　一、淋巴細胞分離實驗

　　淋巴細胞的方便來源是外周血，分離的原則是收率較高，純度較好，失活較低。無論采用哪種方法，應最大可能保持細胞應有活性。

　　淋巴細胞成功分離后，便于在體外對機體免疫細胞進行鑒定、計數或功能測定；還可以用于E花環試驗、淋巴細胞轉化試驗及淋巴細胞培養（需無菌操作）。

　　【原理】：分離的技術可根據細胞的物理性狀和表面標志設計，根據不同實驗目的可采用密度梯度離心法、吸附分離法和其它特殊分離法。本實驗采用的是密度梯度離心法。該方法是根據各類血細胞比重的差異（外周血中各種細胞的密度不同，人紅細胞密度為1.093，粒細胞為1.092，淋巴細胞為（1.074±0.001），利用比重介于某兩類細胞之間的細胞分離液（等滲的聚蔗糖-泛影葡胺，Ficoll）對血液離心，使一定比重的血細胞依相應的密度梯度分布于不同的獨立帶，從而達到分離的目的。

　　二、E玫瑰花環形成試驗

　　【原理】：人T淋巴細胞表面的CD2分子即綿羊紅細胞受體（ER），在一定的實驗條件下，可與綿羊紅細胞（SRBC）結合，形成玫瑰花結，稱為E玫瑰花環試驗(erythrocyte-roseette formation test)。該試驗常用于臨床檢測人外周血T淋巴細胞的數量和比例，由此可間接反映機體的細胞免疫功能狀況。

　　總E花環和活躍花環：

　　淋巴細胞與SRBC在4℃ 環境作用2h 以上形成花環，代表外周血中T細胞總數占淋巴細胞的百分比，稱為總E花環實驗（Et）。

　　如果兩種細胞懸液混合后，不經37℃和4℃ 作用立即反應仍有部分淋巴細胞形成花環，稱為活躍花環（Ea），代表對SRBC親和力高的一個T細胞亞群。

　　①總花環實驗（Et花環）實驗結果

　　計數花環個數，結合3個以上的SRBC為一個花環，計數200個淋巴細胞，計算E花環形成率，正常值為50%-80%。

　　E花環形成率＝ 形成花結的淋巴細胞數 / 淋巴細胞總數 （形成花結+未形成花結） ×100 %

　　②活躍花環試驗（Ea花環實驗結果）

　　Ea花環的結果代表T淋巴細胞中一類亞群，計數花環個數，結合3個以上的SRBC為一個花環，計算E花環形成率，正常值為20%-30%。

　　E花環形成率＝形成花結的淋巴細胞數 / 淋巴細胞總數 （形成花結+未形成花結）× 100 %

　　三、T淋巴細胞轉化試驗

　　【原理】：T淋巴細胞與許多特異或非特異抗原在體外共同培養時，細胞的代謝和形態可以發生一系列的變化：細胞形態向淋巴母細胞的轉化；電荷的改變；細胞內蛋白質和核酸合成的增加。

　　【結果觀察】：

　　①轉化細胞：

　　淋巴母細胞：體積大，核膜清楚，染色質疏松呈細 網狀，核/細胞比例變小。

　　過渡型淋巴細胞：類似母細胞。

　　核絲分裂相細胞：核體呈現有絲分裂，胞內可見組織染色體。

　　②未轉化細胞：

　　成熟小淋巴細胞：體積小，核染色體致密，核/細胞比例大。

　　轉化率計算：轉化率＝轉化的細胞數/淋巴細胞總計數 × 100 %

　　計數200個淋巴細胞，評價標準： 60-80%為正常，50-59%為偏低，<50%為降低。

　　體外刺激物種類：

　　非特異抗原刺激物：如PHA、ConA等

　　特異性抗原刺激物：如PPD

　　細胞抗原和抗淋巴細胞抗體：如同種白細胞、抗淋巴細胞血清等

　　四、淋巴細胞增殖實驗（MTT法）

　　【原理】：MTT比色法是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。

　　該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。

　　五、細胞因子的測定（ELISA）

　　T細胞在受到非特異性有絲分裂原（PHA/CohA）刺激后，或者特異性抗原刺激被激活后，其形態和代謝產生一系列變化，會產生很多細胞因子。

　　培養72小時的淋巴細胞上清液，用ELISA的方法測定上清中的IL-2的含量。

　　【原理】ELISA競爭法：先用特異性抗體（抗IL-2 Ab）包被固相載體，然后同時加入待測抗原（上清液中的IL-2）和酶標記的抗原（酶標的IL-2），待測樣本中的抗原與酶標記抗原競爭性的與固相載體上的特異性抗體結合，溫育一段時間后洗滌，加入底物顯色，測定其415nm處的OD值。為了定量，還應做一系列標準品，測定其OD值并繪制標準曲線，再根據樣品的OD值在曲線上查出其對應的IL-2含量