水稻LEA基因組規模的鑒定與分析

實驗概要

本實驗鑒定了OsLEA基因，將基因定位到水稻染色上，進行了序列對比和基因轉變分析，LEA基因的表達分析及啟動子基序分析。

實驗材料

基因組及蛋白質序列的來源：

分別從TIGR (http://www.tigr.org)和BGI (http://rise.genomics.org.cn/rice/link/download.jsp)下載Nipponbare和93-11基因組序列數據。從網站(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/下載32127Nipponbare全長cDNA序列。白楊基因組數據從網站(http://genome.jgi-psf.org/Poptr1/ Poptr1.home.html)下載。所有數據的處理和分析皆在IBM P650的服務器上完成，使用IBM AIX的Unix操作系統。

實驗步驟

1. OsLEA基因的鑒定

使用HMMER的hmmpfam功能模塊，從Pfam數據庫(http://www.sanger.ac.ulc/Software/Pfam)上搜索一段己知的LEA基因序列，LEA蛋白的HMM譜將其分成七類，分別是LEA_1， LEA-2，  LEA-3，LEAwe-4，LEA-5，Dehydrin和SMP。這些簡圖被用于在TIGR   (http://www.tigr.org/tdb/e2kl/osalpseudornolecules/info.shtml)上用HMMSEARCH程序掃描日本水稻基因組的染色體。在鑒定OsLEA基因后，將基因定位到水稻染色上。另外，從KOME(http://cdna0l.dna.affrc.go. jp/cDNA/)下載水稻的32，000全長cDNA (FL-cDNA)，通過全長cDNA和OsLEA基因的比對研究OsLEA基因的可變選擇性剪接。

2. 序列對比和基因轉變分析

用CLUSTAL X (V 1.81)程序在默認設置下完成預測OsLEA基因多序列比對。人工去除不保守區域。用GENECONV程序進行基因轉換檢驗，計算出全局和成對P值來估計被觀察片斷長度的統計顯著性。

3. LEA基因的表達分析

通過生物信息和實驗的方法研究OsLEA基因的表達。在生物信息方法的分析中，我們從TIGR Plant Transcript Assemblies (http://plantta.tigr.orgo)上選用BLASTN比對，取匹配率大于95%，檢索到OsLEA基因的FL-cDNA序列和EST序列。另外，從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.，gov/geo/)上的GEO下載了兩組水稻基因芯片數據來檢驗OsLEA基因的表達情況。其中一組為GSE661，含有ABA處理和GA處理的GSM9853，GSM9854，GSM9855，GSM9857，GSM9858，GSM9859和GSM9860。另一組是GSE2415，在幼苗時期經過FS，FD，Dr，Os，滲透和冷害。

在實驗分析中，用半定量RT-PCR檢測用ABA或脅迫處理的一些OsLEA基因的表達情況。在溫室中用水培法種植粳稻的日本睛品種。在播種40天后分別用15%(v/v)PEG6000，0.1mM ABA和200mM NaCl處理六小時。未經處理的幼苗作為對照。利用Trizol試劑盒，按照手冊的說明和Dnase處理，從對照和處理的幼苗地上部分提取總RNA。從總RNA合成cDNA第一鏈并做為sqRT PCR的模板。SqRT PCR的過程為：95℃ 5min，接著是95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，82℃ 5min循環32次，最后72℃延伸5mino OsLEA基因使用的擴增引物如表2所示。此外，在sqRT-PCR中使用肌動蛋白基因作為對照，以確保每次反應中消耗等量的cDNA。肌動蛋白基因使用的引物為5'-GGAACTGGTATGGTCAAGGC-3’和5'-AGTCTCATGGATACCCGCAG-3’。

4. 啟動子基序分析

基于微陣列數據，OsLEA基因被分成受ABA處理或干旱處理誘導表達和無誘導表達兩組。檢驗誘導調控和非誘導調控的兩組基因，每個OsLEA基因利用全長cDNA來確定5’端上游1，00bp序列，從而來確定受ABA或干旱誘導的保守序列(順式作用元件)。用ELPH (http://www.cbcb.umd.edu/software/ELPH)程序的Gibbs取樣方法的默認參數設置來獲得保守序列。使用WebLogo程序將確定的基序按照它們在區域中的位置和它們的一致順序來劃分。